Protokollen beskriver en ny in vivo musemodel af spinalimplantatinfektion, hvor et rustfrit stål k-wire implantat er inficeret med bioluminescerende Staphylococcus aureus Xen36. Bakteriebyrden overvåges i længderetningen med bioluminescerende billeddannelse og bekræftes med kolonidannende enhedstællinger efter eutanasi.
Rygsøjleimplantatinfektioner giver dårlige resultater, da diagnosen er udfordrende, og kirurgisk udryddelse er i modstrid med mekanisk rygmarvsstabilitet. Formålet med denne metode er at beskrive en ny musemodel af rygmarvsimplantatinfektion (SII), der blev oprettet for at give et billigt, hurtigt og præcist in vivo-værktøj til at teste potentielle terapeutiske og behandlingsstrategier for rygmarvsimplantatinfektioner.
I denne metode præsenterer vi en model af posterior-approach spinal kirurgi, hvor en rustfri stål k-wire transfikseres til L4 spinous processen af 12 uger gamle C57BL/6J vildtypemus og podes med 1 x 103 CFU af en bioluminescerende stamme af Staphylococcus aureus Xen36 bakterier. Mus afbildes derefter i længderetningen for bioluminescens in vivo på postoperative dage 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 og 35. Bioluminescensbilleddannelsessignaler (BLI) fra et standardiseret synsfelt kvantificeres for at måle in vivo bakteriel byrde.
For at kvantificere bakterier, der klæber til implantater og periimplantatvæv, aflives mus, og implantatet og det omgivende bløde væv høstes. Bakterier løsnes fra implantatet ved sonikering, dyrkes natten over, og derefter tælles kolonidannende enheder (CFU’er). Resultaterne opnået ved denne metode omfatter langsgående bakterietal målt ved in vivo S. aureus-bioluminescens (gennemsnitlig maksimal flux) og CFU-tællinger efter eutanasi.
Mens tidligere dyremodeller af instrumenteret rygsøjleinfektion har involveret invasiv, ex vivo vævsanalyse, udnytter musemodellen af SII, der præsenteres i dette papir, ikke-invasiv, realtids in vivo optisk billeddannelse af bioluminescerende bakterier til at erstatte statisk vævsundersøgelse. Anvendelser af modellen er brede og kan omfatte anvendelse af alternative bioluminescerende bakteriestammer, inkorporering af andre typer genetisk manipulerede mus til samtidig undersøgelse af værtsimmunrespons og evaluering af nuværende eller undersøgelse af nye diagnostiske og terapeutiske modaliteter såsom antibiotika eller implantatbelægninger.
Formålet med denne metode er at beskrive en ny musemodel for rygmarvsimplantatinfektion (SII). Denne model er designet til at give et billigt og præcist værktøj til fleksibelt at vurdere effekten af værts-, patogen- og/eller implantatvariabler in vivo. Test af potentielle terapeutiske og behandlingsstrategier for rygmarvsimplantatinfektioner i denne model har til formål at styre forskningsudviklingen forud for anvendelse i større dyremodeller og kliniske forsøg.
Implantatrelateret infektion efter rygsøjleoperation er en ødelæggende komplikation og forekommer desværre hos ca. 3-8% af patienterne, der gennemgår elektiv rygsøjlekirurgi 1,2,3,4,5 og op til 65% af patienterne, der gennemgår multilevel eller revisionskirurgi6. Behandling af rygmarvsimplantatinfektioner kræver ofte flere indlæggelser, flere operationer og langvarig antibiotikabehandling. SII’er viser dårlige patientresultater, herunder neurologisk kompromis, handicap og en øget risiko for dødelighed. Håndtering af SII er ekstremt dyrt og koster op mod $ 900.000 pr. Patient7.
Staphylococcus aureus er det mest almindelige virulente patogen af SII 8,9,10,11. Bakterier kan frø hardwaren direkte under operationen, gennem såret i den postoperative periode eller senere via hæmatogen spredning. I nærvær af metalimplantater danner S. aureus biofilm, der beskytter bakterierne mod antibiotikabehandling og immunceller. Mens fjernelse af inficeret hardware kan hjælpe med effektivt at udrydde en infektion, er dette ofte ikke muligt i rygsøjlen uden at forårsage destabilisering og risikere neurologisk kompromis12.
I mangel af udplantning af inficeret hardware er der behov for nye tilgange til at forebygge, opdage og behandle SII. Historisk set har der været begrænsede dyremodeller af SII til effektivt at vurdere sikkerheden og effekten af nye terapier. Tidligere dyremodeller af SII kræver et stort antal dyr og indsamling af datapunkter, der kræver eutanasi, herunder kolonitælling, histologi og kultur13,14,15. Da disse modeller mangler langsgående in vivo-overvågning, giver de kun ét datapunkt pr. dyr og er derfor dyre og ineffektive.
Tidligere arbejde, der studerede en musemodel af knæartroplastikinfektion, fastslog værdien og nøjagtigheden af ikke-invasiv in vivo optisk billeddannelse til langsgående overvågning af infektionsbyrden16. Påvisning af bioluminescens gør det muligt at kvantificere bakteriebyrden over et langsgående tidsforløb i et enkelt dyr humant, præcist og effektivt. Desuden har tidligere undersøgelser vist en høj korrelation mellem in vivo-bioluminescens og CFU’er, der klæber til implantater17. Evnen til at spore infektion over tid har ført til en mere nuanceret forståelse af implantatrelateret infektion. Derudover har overvågning af langsgående infektion på denne måde gjort det muligt at vurdere effektiviteten af antibiotikabehandling og nye antimikrobielle stoffer nøjagtigt16,17,18.
Ved at udnytte disse værktøjer udviklede og validerede vi en model for postoperativ spinalimplantatinfektion. I den præsenterede metode bruger vi et inokulum af bioluminescerende S. aureus Xen36 til at etablere en in vivo musemodel af SII til langsgående overvågning af bakteriebyrden16,17,18. Denne nye model giver et værdifuldt værktøj til effektivt at teste potentielle detektions-, forebyggelses- og behandlingsstrategier for SII, inden de anvendes i større dyremodeller og kliniske forsøg.
Implantatrelaterede infektioner i rygsøjlen varsler dårlige resultater for patienter 1,2,3,4,5. I modsætning til mange andre områder i kroppen kan inficeret hardware i rygsøjlen ofte ikke fjernes på grund af risikoen for ustabilitet og neurologisk kompromis. Denne unikke udfordring i forbindelse med indstilling af biofilmbakterier, der er resistente over…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende modtagelsen af både Pediatric Orthopaedic Society of North America Biomet Spine Grant og National Institutes of Health Clinical and Translational Science Institute KL2 Grant og HH Lee Surgical Research Grant som vigtige finansieringskilder til disse eksperimenter.
Analytical Balance ME104 | Mettler Toledo | 30029067 | 120 g capacity, 0.1 mg readability, backlit LCD, internal adjustment, metal base |
BD Bacto Tryptic Soy Broth | Becton Dickinson (BD) | BD 211825 | BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium) |
Biomate 3S UV-VIS Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-208300 | Spectrophotometer; Thermo Scientific; BioMate 3S; Six-position cell holder; Spectral bandwidth: 1.8nm; Long-life xenon lamp; Store up to 40 test methods; 16L x 13W x 9 in. H; 19 lb.; 100/240V US line cord |
Bioshield 720+ swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 75003183 | Rotor, Swinging bucket; Thermo Scientific; BIOShield 720 high speed; Capacity: 4 x 180mL (0.72L); Angle: 90 deg. ; Max. speed/RCF: 6300rpm/7188 x g; Max. radius: 16.2cm |
Branson Ultrasonics 2510R-MTH (Sonicator) | Branson Ultrasonics | CPX952217R | *similar model, our model is discontinued* Branson Ultrasonics MH Series Heated Ultrasonic Cleaning Bath, 120V, 0.75 gal |
Bullet Blender Storm Homogenizer | Next Advance | BBY24M | The Bullet Blender Storm is the most powerful member of the Bullet Blender family. Homogenize up to 24 of your toughest samples (mouse femur, skin, cartilage, tumor, etc.) in just minutes. Air cooling™ minimizes sample heat up. Uses 1.5ml screw-cap RINO® tubes or snap-cap Eppendorf® Safe-lock™ tubes. |
Germinator 500 | Electron Microscopy Sciences | 66118-10 | The Germinator 500 is designed to decontaminate metal micro-dissecting instruments only. It is to be used exclusively for research purposes. The Germinator 500 should not be used as a substitute for traditional methods of terminal sterilization. Effective sterilization cannot be assured due to lack of routine sterilization-efficacy monitoring methods for glass bead sterilization. The Germinator 500 has been designed and built to pass the Validation of Dry Sterilizer Spore Suspension Test: USP XXIII, Part 1211. |
Heracell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | Single 150L |
IVIS Lumina X5 Imaging System | Perkin Elmer | CLS148590 | The IVIS Lumina X5 high-throughput 2D optical imaging system combines high-sensitivity bioluminescence and fluorescence with high-resolution x-ray into a compact system that fits on your benchtop. With an expanded 5 mouse field of view for 2D optical imaging plus our unique line of accessories to accelerate setup and labeling, it has never been easier or faster to get robust data—and answers—on anatomical and molecular aspects of disease. |
MAXQ 4450 Digtial Incubating Bench Shaker | Thermo Scientific | SHKE4450 | Shaker, Incubated; Thermo Scientific; Digital; MaxQ 4450; Speed 15 to 500rpm +/-1rpm; 5 deg. C above ambient to 80 deg. C; 120V 50/60Hz |
PBS, Phosphate Buffered Saline | Fisher Bioreagents | BP24384 | PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4 |
Sorvall Legend Micro 21 Centrifuge, Ventilated | Thermo Scientific | 75002436 | 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal biocontainment lid |
SORVALL LEGEND X1R 120V Centrifuge | Thermo Scientific | 75004261 | Centrifuge, Benchtop; Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R (Refrigerated), 1L capacity; Max. Speed/RCF 15,200rpm/25,830 x g; CFC-free cooling -10C to +40C; 120V 60Hz |
Staphylococcus aureus – Xen36 | Perkin Elmer | 119243 | Staphylococcus aureus – Xen36 bioluminescent pathogenic bacteria for in vivo and in vitro drug discovery. This product was derived from a parental strain from the American Type Culture Collection, used under license. Staph. aureus-Xen36 possesses a stable copy of the Photorhabdus luminescens lux operon on the native plasmid. |
TUTTNAUER AUTOCLAVE 2540E 120V | Heidolph Tuttnauer | 23210401 | Sterilizer, Benchtop; Heidolph; Tuttnauer; Model 2540E; Self-contained design with refillable reservoir controls water purity for sterilization; 120V 50/60Hz; 1400w. With electronic controls |
Tween 80 | Fisher Bioreagents | BP338-500 | Tween 80, Fisher BioReagents, Non-ionic detergent for selective protein extraction |
Vortex mixer VX-200 | Labnet Internation | S0200 | 120V touch or continuous mixer, 230V: 0 – 2,850 rpm,120V: 0 – 3,400 rpm |
0.9% Sodium Chloride | Pfizer Injectables/Hospira | 00409-4888-10 | 0.9% Sodium Chloride Injection, USP |