Modèle murin in vivo d’infection par implant rachidien

Summary

Le protocole décrit un nouveau modèle murin in vivo d’infection par implant rachidien où un implant k-wire en acier inoxydable est infecté par Staphylococcus aureus Xen36 bioluminescent. La charge bactérienne est surveillée longitudinalement par imagerie bioluminescente et confirmée par le nombre d’unités formant colonie après euthanasie.

Abstract

Les infections des implants rachidiens laissent présager de mauvais résultats, car le diagnostic est difficile et l’éradication chirurgicale est en contradiction avec la stabilité mécanique de la colonne vertébrale. L’objectif de cette méthode est de décrire un nouveau modèle murin d’infection par implant rachidien (SII) qui a été créé pour fournir un outil in vivo peu coûteux, rapide et précis pour tester des thérapies potentielles et des stratégies de traitement pour les infections par implants vertébraux.

Dans cette méthode, nous présentons un modèle de chirurgie de la colonne vertébrale par voie postérieure dans lequel un fil k en acier inoxydable est transfigé dans l’apophyse épineuse L4 de souris de type sauvage C57BL/6J âgées de 12 semaines et inoculé avec 1 x 10³ UFC d’une souche bioluminescente de la bactérie Staphylococcus aureus Xen36. Les souris sont ensuite imagées longitudinalement pour la bioluminescence in vivo les jours postopératoires 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 et 35. Les signaux d’imagerie par bioluminescence (BLI) provenant d’un champ de vision normalisé sont quantifiés pour mesurer la charge bactérienne in vivo.

Pour quantifier l’adhérence des bactéries aux implants et aux tissus péri-implantaires, les souris sont euthanasiées et l’implant et les tissus mous environnants sont prélevés. Les bactéries sont détachées de l’implant par sonication, cultivées pendant la nuit, puis les unités formant colonie (UFC) sont comptées. Les résultats obtenus à l’aide de cette méthode comprennent les numérations bactériennes longitudinales mesurées par bioluminescence in vivo de S. aureus (flux maximal moyen) et les numérations d’UFC après euthanasie.

Alors que les modèles animaux antérieurs d’infection de la colonne vertébrale instrumentée impliquaient une analyse tissulaire invasive ex vivo, le modèle murin de SII présenté dans cet article tire parti de l’imagerie optique in vivo non invasive en temps réel des bactéries bioluminescentes pour remplacer l’étude statique des tissus. Les applications du modèle sont vastes et peuvent inclure l’utilisation de souches bactériennes bioluminescentes alternatives, l’incorporation d’autres types de souris génétiquement modifiées pour étudier simultanément la réponse immunitaire de l’hôte, et l’évaluation des modalités diagnostiques et thérapeutiques actuelles ou en recherche de nouvelles telles que les antibiotiques ou les revêtements d’implants.

Introduction

L’objectif de cette méthode est de décrire un nouveau modèle murin d’infection par implant rachidien (SII). Ce modèle a été conçu pour fournir un outil peu coûteux et précis permettant d’évaluer de manière flexible l’effet des variables de l’hôte, de l’agent pathogène et/ou de l’implant in vivo. La mise à l’essai de thérapies potentielles et de stratégies de traitement pour les infections par implants rachidiens dans ce modèle vise à guider le développement de la recherche avant l’application dans des modèles animaux plus grands et des essais cliniques.

L’infection liée à l’implant après une chirurgie de la colonne vertébrale est une complication dévastatrice et survient malheureusement chez environ 3 à 8 % des patients subissant une chirurgie élective de la colonne vertébrale 1,2,3,4,5 et jusqu’à 65 % des patients subissant une chirurgie à plusieurs niveaux ou une chirurgie de révision⁶. Le traitement des infections par implants rachidiens nécessite souvent de multiples hospitalisations, de multiples interventions chirurgicales et une antibiothérapie prolongée. Les SII laissent présager de mauvais résultats pour les patients, notamment une atteinte neurologique, une invalidité et un risque accru de mortalité. La prise en charge de l’IS est extrêmement coûteuse, coûtant plus de 900 000 $ par patient⁷.

Staphylococcus aureus est l’agent pathogène virulent le plus courant du SII 8,9,10,11. Les bactéries peuvent ensemencer le matériel directement pendant la chirurgie, à travers la plaie pendant la période postopératoire ou plus tard via la propagation hématogène. En présence d’implants métalliques, S. aureus forme un biofilm qui protège les bactéries de l’antibiothérapie et les cellules immunitaires. Bien que l’élimination du matériel infecté puisse aider à éradiquer efficacement une infection, cela n’est souvent pas possible dans la colonne vertébrale sans provoquer de déstabilisation et risquer une atteinte neurologique¹².

En l’absence d’explantation de matériel infecté, de nouvelles approches sont nécessaires pour prévenir, détecter et traiter le SII. Historiquement, il y a eu peu de modèles animaux de SII pour évaluer efficacement l’innocuité et l’efficacité de nouvelles thérapies. Les modèles animaux antérieurs de SII nécessitaient un grand nombre d’animaux et la collecte de points de données nécessitant l’euthanasie, y compris le comptage des colonies, l’histologie et la culture^13,14,15. En l’absence d’un suivi longitudinal in vivo, ces modèles ne fournissent qu’un seul point de données par animal et sont donc coûteux et inefficaces.

Des travaux antérieurs portant sur un modèle murin d’infection par arthroplastie du genou ont permis d’établir la valeur et la précision de l’imagerie optique in vivo non invasive pour surveiller longitudinalement la charge de l’infection¹⁶. La détection de la bioluminescence permet de quantifier la charge bactérienne sur une période longitudinale chez un seul animal de manière humaine, précise et efficace. De plus, des études antérieures ont démontré une forte corrélation entre la bioluminescence in vivo et l’adhérence des UFC aux implants¹⁷. La capacité de suivre l’infection au fil du temps a conduit à une compréhension plus nuancée de l’infection liée à l’implant. De plus, le suivi de l’infection longitudinale de cette manière a permis d’évaluer avec précision l’efficacité de l’antibiothérapie et des nouveaux antimicrobiens^16,17,18.

En nous appuyant sur ces outils, nous avons développé et validé un modèle d’infection postopératoire des implants rachidiens. Dans la méthode présentée, nous utilisons un inoculum de S. aureus Xen36 bioluminescent pour établir un modèle murin in vivo de SII afin de surveiller longitudinalement la charge bactérienne^16,17,18. Ce nouveau modèle fournit un outil précieux pour tester efficacement les stratégies potentielles de détection, de prévention et de traitement de l’IS avant leur application dans des modèles animaux et des essais cliniques de plus grande envergure.

Protocol

Tous les animaux ont été manipulés en stricte conformité avec les bonnes pratiques animales telles que définies dans les règlements fédéraux tels qu’énoncés dans la Loi sur le bien-être des animaux (AWA), le Guide de 1996 pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, la Politique de PHS pour le soin et l’utilisation sans cruauté des animaux de laboratoire, ainsi que les politiques et procédures de l’établissement telles qu’énoncées dans le Manuel de formation sur le soin et l’utili…

Representative Results

La procédure présentée ici a été utilisée pour évaluer l’efficacité des régimes antibiotiques dans un modèle murin in vivo de SII. Plus précisément, l’efficacité de l’antibiothérapie combinée à la vancomycine et à la rifampicine a été comparée à celle de la vancomycine en monothérapie et à celle de témoins infectés non traités. Avant la chirurgie, les souris ont été randomisées pour recevoir une thérapie combinée, une monothérapie ou un contrôle infecté….

Discussion

Les infections liées aux implants dans la colonne vertébrale laissent présager de mauvais résultats pour les patients 1,2,3,4,5. Contrairement à de nombreuses autres zones du corps, le matériel infecté de la colonne vertébrale ne peut souvent pas être retiré en raison du risque d’instabilité et de compromission neurologique. Ce défi unique dans l…

Materials

Analytical Balance ME104	Mettler Toledo	30029067	120 g capacity, 0.1 mg readability, backlit LCD, internal adjustment, metal base
BD Bacto Tryptic Soy Broth	Becton Dickinson (BD)	BD 211825	BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium)
Biomate 3S UV-VIS Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-208300	Spectrophotometer; Thermo Scientific; BioMate 3S; Six-position cell holder; Spectral bandwidth: 1.8nm; Long-life xenon lamp; Store up to 40 test methods; 16L x 13W x 9 in. H; 19 lb.; 100/240V US line cord
Bioshield 720+ swinging bucket rotor	Thermo Scientific	75003183	Rotor, Swinging bucket; Thermo Scientific; BIOShield 720 high speed; Capacity: 4 x 180mL (0.72L); Angle: 90 deg. ; Max. speed/RCF: 6300rpm/7188 x g; Max. radius: 16.2cm
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Germinator 500	Electron Microscopy Sciences	66118-10	The Germinator 500 is designed to decontaminate metal micro-dissecting instruments only. It is to be used exclusively for research purposes. The Germinator 500 should not be used as a substitute for traditional methods of terminal sterilization. Effective sterilization cannot be assured due to lack of routine sterilization-efficacy monitoring methods for glass bead sterilization. The Germinator 500 has been designed and built to pass the Validation of Dry Sterilizer Spore Suspension Test: USP XXIII, Part 1211.
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PBS, Phosphate Buffered Saline	Fisher Bioreagents	BP24384	PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4
Sorvall Legend Micro 21 Centrifuge, Ventilated	Thermo Scientific	75002436	24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal biocontainment lid
SORVALL LEGEND X1R 120V Centrifuge	Thermo Scientific	75004261	Centrifuge, Benchtop; Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R (Refrigerated), 1L capacity; Max. Speed/RCF 15,200rpm/25,830 x g; CFC-free cooling -10C to +40C; 120V 60Hz
Staphylococcus aureus – Xen36	Perkin Elmer	119243	Staphylococcus aureus – Xen36 bioluminescent pathogenic bacteria for in vivo and in vitro drug discovery. This product was derived from a parental strain from the American Type Culture Collection, used under license. Staph. aureus-Xen36 possesses a stable copy of the Photorhabdus luminescens lux operon on the native plasmid.
TUTTNAUER AUTOCLAVE 2540E 120V	Heidolph Tuttnauer	23210401	Sterilizer, Benchtop; Heidolph; Tuttnauer; Model 2540E; Self-contained design with refillable reservoir controls water purity for sterilization; 120V 50/60Hz; 1400w. With electronic controls
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