במודל עכבר Vivo של זיהום שתל בעמוד השדרה
Summary
הפרוטוקול מתאר מודל עכבר in vivo חדשני של זיהום שתל בעמוד השדרה שבו שתל חוט K מפלדת אל-חלד נגוע בסטפילוקוקוס אאורוס Xen36 ביולומינסנטי. עומס חיידקי מנוטר לאורך עם הדמיה ביולומינסנטית ומאושר עם ספירת יחידות יוצרות מושבה לאחר המתת חסד.
Abstract
זיהומים בשתלי עמוד השדרה מבשרים תוצאות גרועות מכיוון שהאבחון מאתגר ומיגור כירורגי מנוגד ליציבות המכנית של עמוד השדרה. מטרת שיטה זו היא לתאר מודל עכברי חדשני של זיהום שתל עמוד השדרה (SII) שנוצר כדי לספק כלי invivo זול, מהיר ומדויק לבדיקת טיפולים פוטנציאליים ואסטרטגיות טיפול בזיהומים של שתלי עמוד השדרה.
בשיטה זו, אנו מציגים מודל של ניתוחי עמוד שדרה בגישה אחורית שבו חוט k מפלדת אל-חלד מועתק לתהליך עמוד השדרה L4 של עכברי בר בני 12 שבועות מסוג C57BL/6J ומחוסן ב-1 x 103 CFU של זן ביולומינסנטי של חיידקי Staphylococcus aureus Xen36. לאחר מכן עכברים מצולמים לאורך, עבור bioluminescence in vivo בימים 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 ו-35. אותות דימות ביולומינסנציה (BLI) משדה ראייה סטנדרטי מכומתים כדי למדוד עומס חיידקי in vivo.
כדי לכמת חיידקים הנצמדים לשתלים ולרקמה הפרי-שתלית, ממיתים עכברים וקוצרים את השתל ואת הרקמה הרכה שמסביבו. חיידקים מנותקים מהשתל על ידי סוניקציה, מתורבתים במשך הלילה ולאחר מכן יחידות יוצרות מושבה (CFUs) נספרות. התוצאות המתקבלות משיטה זו כוללות ספירות חיידקים אורכיות כפי שנמדדו על ידי in vivo S. aureus bioluminescence (שטף מרבי ממוצע) וספירות CFU לאחר המתת חסד.
בעוד שמודלים קודמים של בעלי חיים של זיהום מכשור בעמוד השדרה כללו ניתוח פולשני של רקמות ex vivo, מודל העכבר של מכון התקנים המוצג במאמר זה ממנף הדמיה אופטית לא פולשנית בזמן אמת in vivo של חיידקים ביולומינסנטיים כדי להחליף מחקר רקמות סטטיות. היישומים של המודל הם רחבים ועשויים לכלול שימוש בזני חיידקים ביולומינסנטיים חלופיים, שילוב סוגים אחרים של עכברים מהונדסים גנטית כדי לחקור בו זמנית את התגובה החיסונית של המאכסן, והערכת שיטות אבחון וטיפול חדשות או חקירה כגון אנטיביוטיקה או ציפויי שתלים.
Introduction
מטרת שיטה זו היא לתאר מודל עכברי חדשני של זיהום שתל בעמוד השדרה (SII). מודל זה תוכנן לספק כלי זול ומדויק להערכה גמישה של ההשפעה של משתנים מארחים, פתוגנים ו / או שתלים in vivo. בחינת טיפולים פוטנציאליים ואסטרטגיות טיפול לזיהומים של שתלי עמוד השדרה במודל זה נועדה להנחות את פיתוח המחקר לפני היישום במודלים גדולים יותר של בעלי חיים ובניסויים קליניים.
זיהום הקשור לשתלים לאחר ניתוח בעמוד השדרה הוא סיבוך הרסני ולמרבה הצער מתרחש בכ-3-8% מהמטופלים שעברו ניתוח אלקטיבי בעמוד השדרה 1,2,3,4,5 ועד 65% מהמטופלים שעברו ניתוח רב-שלבי או רוויזיה 6. טיפול בזיהומים של שתלי עמוד השדרה דורש לעתים קרובות אשפוזים מרובים, ניתוחים מרובים וטיפול אנטיביוטי ממושך. מכון התקנים מבשר על תוצאות גרועות של מטופלים, כולל פגיעה נוירולוגית, נכות וסיכון מוגבר לתמותה. ניהול מכון התקנים יקר ביותר ועולה למעלה מ-900,000 דולר למטופל7.
סטפילוקוקוס זהוב הוא הפתוגן האלים הנפוץ ביותר של מכון התקנים 8,9,10,11. חיידקים יכולים לזרוע את החומרה ישירות במהלך הניתוח, דרך הפצע בתקופה שלאחר הניתוח, או מאוחר יותר באמצעות התפשטות hematogenous. בנוכחות שתלי מתכת, S. aureus יוצרים ביופילם המגן על החיידקים מפני טיפול אנטיביוטי ותאים חיסוניים. בעוד הסרת חומרה נגועה עשויה לסייע במיגור יעיל של זיהום, זה לעתים קרובות לא אפשרי בעמוד השדרה מבלי לגרום לערעור יציבות ולהסתכן בפגיעה נוירולוגית12.
בהיעדר שתילה של חומרה נגועה, נדרשות גישות חדשניות למניעה, גילוי וטיפול במכון התקנים. מבחינה היסטורית, היו מודלים מוגבלים של בעלי חיים של מכון התקנים כדי להעריך ביעילות את הבטיחות והיעילות של טיפולים חדשניים. מודלים קודמים של בעלי חיים במכון התקנים דורשים מספר רב של בעלי חיים ואיסוף נקודות נתונים הדורשות המתת חסד כולל ספירת מושבות, היסטולוגיה ותרבות13,14,15. בהיעדר ניטור אורכי in vivo, מודלים אלה מספקים נקודת נתונים אחת בלבד לכל בעל חיים ולכן הם יקרים ולא יעילים.
עבודה קודמת שחקרה מודל עכברי של זיהום ארתרופלסטי בברך ביססה את הערך והדיוק של הדמיה אופטית לא פולשנית in vivo לניטור אורכי של עומס זיהום16. זיהוי ביולומינסנציה מאפשר לכמת את העומס החיידקי על פני מסלול זמן אורכי בחיה אחת באופן הומני, מדויק ויעיל. יתר על כן, מחקרים קודמים הדגימו מתאם גבוה בין ביולומינסנציה in vivo לבין CFUs הדבקים בשתלים17. היכולת לעקוב אחר זיהום לאורך זמן, הובילה להבנה מורכבת יותר של זיהום הקשור לשתלים. בנוסף, ניטור זיהום אורכי בדרך זו, איפשר את היעילות של טיפול אנטיביוטי ומיקרוביאלים חדשים להיות מוערך במדויק16,17,18.
תוך מינוף כלים אלה, פיתחנו ותיקפנו מודל של זיהום בשתל עמוד השדרה לאחר הניתוח. בשיטה שהוצגה, אנו משתמשים בחיסון של S. aureus Xen36 ביולומינסנט כדי לבסס מודל עכבר in vivo של מכון התקנים לניטור אורכי של עומס חיידקי16,17,18. מודל חדשני זה מספק כלי רב ערך לבדיקה יעילה של אסטרטגיות זיהוי, מניעה וטיפול פוטנציאליות עבור מכון התקנים לפני יישומן במודלים גדולים יותר של בעלי חיים ובניסויים קליניים.
Protocol
Representative Results
Discussion
זיהומים הקשורים לשתלים בעמוד השדרה מבשרים תוצאות גרועות עבור חולים 1,2,3,4,5. שלא כמו אזורים רבים אחרים בגוף, חומרה נגועה בעמוד השדרה לעתים קרובות לא ניתן להסיר בשל הסיכון של חוסר יציבות ופגיעה נוירולוג?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להכיר בקבלת מענק Biomet Spine של האגודה האורתופדית לילדים בצפון אמריקה והמכון הלאומי לבריאות, קליני ומדעי תרגום KL2, ומענק המחקר הכירורגי HH Lee כמקורות מימון עיקריים לניסויים אלה.
Materials
| Analytical Balance ME104 | Mettler Toledo | 30029067 | 120 g capacity, 0.1 mg readability, backlit LCD, internal adjustment, metal base |
| BD Bacto Tryptic Soy Broth | Becton Dickinson (BD) | BD 211825 | BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium) |
| Biomate 3S UV-VIS Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-208300 | Spectrophotometer; Thermo Scientific; BioMate 3S; Six-position cell holder; Spectral bandwidth: 1.8nm; Long-life xenon lamp; Store up to 40 test methods; 16L x 13W x 9 in. H; 19 lb.; 100/240V US line cord |
| Bioshield 720+ swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 75003183 | Rotor, Swinging bucket; Thermo Scientific; BIOShield 720 high speed; Capacity: 4 x 180mL (0.72L); Angle: 90 deg. ; Max. speed/RCF: 6300rpm/7188 x g; Max. radius: 16.2cm |
| Branson Ultrasonics 2510R-MTH (Sonicator) | Branson Ultrasonics | CPX952217R | *similar model, our model is discontinued* Branson Ultrasonics MH Series Heated Ultrasonic Cleaning Bath, 120V, 0.75 gal |
| Bullet Blender Storm Homogenizer | Next Advance | BBY24M | The Bullet Blender Storm is the most powerful member of the Bullet Blender family. Homogenize up to 24 of your toughest samples (mouse femur, skin, cartilage, tumor, etc.) in just minutes. Air cooling™ minimizes sample heat up. Uses 1.5ml screw-cap RINO® tubes or snap-cap Eppendorf® Safe-lock™ tubes. |
| Germinator 500 | Electron Microscopy Sciences | 66118-10 | The Germinator 500 is designed to decontaminate metal micro-dissecting instruments only. It is to be used exclusively for research purposes. The Germinator 500 should not be used as a substitute for traditional methods of terminal sterilization. Effective sterilization cannot be assured due to lack of routine sterilization-efficacy monitoring methods for glass bead sterilization. The Germinator 500 has been designed and built to pass the Validation of Dry Sterilizer Spore Suspension Test: USP XXIII, Part 1211. |
| Heracell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | Single 150L |
| IVIS Lumina X5 Imaging System | Perkin Elmer | CLS148590 | The IVIS Lumina X5 high-throughput 2D optical imaging system combines high-sensitivity bioluminescence and fluorescence with high-resolution x-ray into a compact system that fits on your benchtop. With an expanded 5 mouse field of view for 2D optical imaging plus our unique line of accessories to accelerate setup and labeling, it has never been easier or faster to get robust data—and answers—on anatomical and molecular aspects of disease. |
| MAXQ 4450 Digtial Incubating Bench Shaker | Thermo Scientific | SHKE4450 | Shaker, Incubated; Thermo Scientific; Digital; MaxQ 4450; Speed 15 to 500rpm +/-1rpm; 5 deg. C above ambient to 80 deg. C; 120V 50/60Hz |
| PBS, Phosphate Buffered Saline | Fisher Bioreagents | BP24384 | PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4 |
| Sorvall Legend Micro 21 Centrifuge, Ventilated | Thermo Scientific | 75002436 | 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal biocontainment lid |
| SORVALL LEGEND X1R 120V Centrifuge | Thermo Scientific | 75004261 | Centrifuge, Benchtop; Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R (Refrigerated), 1L capacity; Max. Speed/RCF 15,200rpm/25,830 x g; CFC-free cooling -10C to +40C; 120V 60Hz |
| Staphylococcus aureus – Xen36 | Perkin Elmer | 119243 | Staphylococcus aureus – Xen36 bioluminescent pathogenic bacteria for in vivo and in vitro drug discovery. This product was derived from a parental strain from the American Type Culture Collection, used under license. Staph. aureus-Xen36 possesses a stable copy of the Photorhabdus luminescens lux operon on the native plasmid. |
| TUTTNAUER AUTOCLAVE 2540E 120V | Heidolph Tuttnauer | 23210401 | Sterilizer, Benchtop; Heidolph; Tuttnauer; Model 2540E; Self-contained design with refillable reservoir controls water purity for sterilization; 120V 50/60Hz; 1400w. With electronic controls |
| Tween 80 | Fisher Bioreagents | BP338-500 | Tween 80, Fisher BioReagents, Non-ionic detergent for selective protein extraction |
| Vortex mixer VX-200 | Labnet Internation | S0200 | 120V touch or continuous mixer, 230V: 0 – 2,850 rpm,120V: 0 – 3,400 rpm |
| 0.9% Sodium Chloride | Pfizer Injectables/Hospira | 00409-4888-10 | 0.9% Sodium Chloride Injection, USP |
Referências
- Verdrengh, M., Tarkowski, A. Role of neutrophils in experimental septicemia and septic arthritis induced by Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 65 (7), 2517-2521 (1997).
- Fang, A., Hu, S. S., Endres, N., Bradford, D. S. Risk factors for infection after spinal surgery. Spine. 30 (12), 1460-1465 (2005).
- Levi, A. D., Dickman, C. A., Sonntag, V. K. Management of postoperative infections after spinal instrumentation. Journal of Neurosurgery. 86 (6), 975-980 (1997).
- Weinstein, M. A., McCabe, J. P., Cammisa, F. P. Postoperative spinal wound infection: a review of 2,391 consecutive index procedures. Journal of Spinal Disorders. 13 (5), 422-426 (2000).
- Picada, R., et al. Postoperative deep wound infection in adults after posterior lumbosacral spine fusion with instrumentation: incidence and management. Journal of Spinal Disorders. 13 (1), 42-45 (2000).
- Smith, J. S., et al. Rates of infection after spine surgery based on 108,419 procedures: a report from the Scoliosis Research Society Morbidity and Mortality Committee. Spine. 36 (7), 556-563 (2011).
- Abbey, D. M., Turner, D. M., Warson, J. S., Wirt, T. C., Scalley, R. D. Treatment of postoperative wound infections following spinal fusion with instrumentation. Journal of Spinal Disorders. 8 (4), 278-283 (1995).
- Silber, J. S., et al. Management of postprocedural discitis. Spine Journal. 2 (4), 279-287 (2002).
- Pappou, I. P., Papadopoulos, E. C., Sama, A. A., Girardi, F. P., Cammisa, F. P. Postoperative infections in interbody fusion for degenerative spinal disease. Clinical Orthopaedics and Related Research. 444, 120-128 (2006).
- Sampedro, M. F., et al. A biofilm approach to detect bacteria on removed spinal implants. Spine. 35 (12), 1218-1224 (2010).
- Pull ter Gunne, A. F., Mohamed, A. S., Skolasky, R. L., van Laarhoven, C. J., Cohen, D. B. The presentation, incidence, etiology, and treatment of surgical site infections after spinal surgery. Spine. 35 (13), 1323-1328 (2010).
- Olsen, M. A., et al. Risk factors for surgical site infection in spinal surgery. Journal of Neurosurgery. 98, 149-155 (2003).
- Ofluoglu, E. A., et al. Implant-related infection model in rat spine. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 127 (5), 391-396 (2007).
- Guiboux, J. P., et al. The role of prophylactic antibiotics in spinal instrumentation. A rabbit model. Spine. 23 (6), 653-656 (1998).
- Stavrakis, A. I., et al. Current Animal Models of Postoperative Spine Infection and Potential Future Advances. Frontiers in Medicine (Lausanne). 2, 34 (2015).
- Pribaz, J. R., et al. Mouse model of chronic post-arthroplasty infection: noninvasive in vivo bioluminescence imaging to monitor bacterial burden for long-term study. Journal of Orthopaedic Research. 30 (3), 335-340 (2012).
- Bernthal, N. M., et al. A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings. PLoS One. 5 (9), 12580 (2010).
- Niska, J. A., et al. Monitoring bacterial burden, inflammation and bone damage longitudinally using optical and muCT imaging in an orthopaedic implant infection in mice. PLoS One. 7 (10), 47397 (2012).
- Francis, K. P., et al. Monitoring bioluminescent Staphylococcus aureus infections in living mice using a novel luxABCDE construct. Infection and Immunity. 68 (6), 3594-3600 (2000).
- Dworsky, E. M., et al. Novel in vivo mouse model of implant related spine infection. Journal of Orthopaedic Research. 35 (1), 193-199 (2017).
- Hegde, S. S., et al. Activity of telavancin against heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus (hVISA) in vitro and in an in vivo mouse model of bacteraemia. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 65 (4), 725-728 (2010).
- Crandon, J. L., Kuti, J. L., Nicolau, D. P. Comparative efficacies of human simulated exposures of telavancin and vancomycin against methicillin-resistant Staphylococcus aureus with a range of vancomycin MICs in a murine pneumonia model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54 (12), 5115-5119 (2010).
- Reyes, N., et al. Efficacy of telavancin in a murine model of bacteraemia induced by methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 58 (2), 462-465 (2006).
- Sakoulas, G., Eliopoulos, G. M., Alder, J., Eliopoulos, C. T. Efficacy of daptomycin in experimental endocarditis due to methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (5), 1714-1718 (2003).
- Hu, Y., et al. Combinatory antibiotic therapy increases rate of bacterial kill but not final outcome in a novel mouse model of Staphylococcus aureus spinal implant infection. PLoS One. 12 (2), 0173019 (2017).
- Poelstra, K. A., Barekzi, N. A., Grainger, D. W., Gristina, A. G., Schuler, T. C. A novel spinal implant infection model in rabbits. Spine. 25 (4), 406-410 (2000).
