Spinal İmplant Enfeksiyonunun İn Vivo Fare Modeli
Summary
Protokol, paslanmaz çelik bir k-tel implantının biyolüminesan Staphylococcus aureus Xen36 ile enfekte olduğu yeni bir in vivo spinal implant enfeksiyonu fare modelini açıklar. Bakteri yükü biyolüminesan görüntüleme ile uzunlamasına izlenir ve ötenazi sonrası koloni oluşturan birim sayıları ile doğrulanır.
Abstract
Omurga implantı enfeksiyonları, tanının zor olması ve cerrahi eradikasyonun mekanik spinal stabilite ile çelişmesi nedeniyle kötü sonuçlara işaret eder. Bu yöntemin amacı, spinal implant enfeksiyonları için potansiyel terapötikleri ve tedavi stratejilerini test etmek için ucuz, hızlı ve doğru bir in vivo araç sağlamak üzere oluşturulmuş yeni bir spinal implant enfeksiyonu (SII) fare modelini tanımlamaktır.
Bu yöntemde, paslanmaz çelik bir k-telinin 12 haftalık C57BL/6J vahşi tip farelerin L4 spinöz sürecine transfikse edildiği ve 1 x 103 CFU biyolüminesan bir Staphylococcus aureus Xen36 bakteri suşu ile aşılandığı bir posterior yaklaşım omurga cerrahisi modeli sunuyoruz. Fareler daha sonra ameliyat sonrası 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 ve 35. günlerde in vivo biyolüminesans için uzunlamasına görüntülenir. Standartlaştırılmış bir görüş alanından alınan biyolüminesans görüntüleme (BLI) sinyalleri, in vivo bakteri yükünü ölçmek için ölçülür.
İmplantlara ve implant çevresi dokuya yapışan bakterileri ölçmek için farelere ötenazi yapılır ve implant ve çevresindeki yumuşak doku hasat edilir. Bakteriler sonikasyon ile implanttan ayrılır, gece boyunca kültürlenir ve daha sonra koloni oluşturan birimler (CFU’lar) sayılır. Bu yöntemden elde edilen sonuçlar, in vivo S. aureus biyolüminesans (ortalama maksimum akı) ve ötenazi sonrası CFU sayıları ile ölçülen uzunlamasına bakteri sayımlarını içerir.
Aletli omurga enfeksiyonunun önceki hayvan modelleri invaziv, ex vivo doku analizini içerirken, bu yazıda sunulan SII’nin fare modeli, statik doku çalışmasının yerini almak için biyolüminesan bakterilerin invaziv olmayan, gerçek zamanlı in vivo optik görüntülemesinden yararlanır. Modelin uygulamaları geniştir ve alternatif biyolüminesan bakteri suşlarının kullanılmasını, konakçı bağışıklık tepkisini eşzamanlı olarak incelemek için diğer genetik olarak tasarlanmış fare türlerini dahil etmeyi ve antibiyotikler veya implant kaplamaları gibi mevcut veya yeni tanı ve tedavi yöntemlerini değerlendirmeyi içerebilir.
Introduction
Bu yöntemin amacı, spinal implant enfeksiyonunun (SII) yeni bir fare modelini tanımlamaktır. Bu model, konakçı, patojen ve/veya implant değişkenlerinin etkisini in vivo olarak esnek bir şekilde değerlendirmek için ucuz ve doğru bir araç sağlamak üzere tasarlanmıştır. Bu modelde spinal implant enfeksiyonları için potansiyel terapötiklerin ve tedavi stratejilerinin test edilmesi, daha büyük hayvan modellerinde ve klinik çalışmalarda uygulamadan önce araştırma geliştirmeye rehberlik etmeyi amaçlamaktadır.
Omurga cerrahisi sonrası implanta bağlı enfeksiyon yıkıcı bir komplikasyondur ve ne yazık ki elektif omurga cerrahisi geçiren hastaların yaklaşık %3-8’inde görülür 1,2,3,4,5 ve çok seviyeli veya revizyon cerrahisi geçiren hastaların %65’ine kadarı 6. Spinal implant enfeksiyonlarının tedavisi genellikle birden fazla hastaneye yatış, birden fazla ameliyat ve uzun süreli antibiyotik tedavisi gerektirir. SII’ler, nörolojik uzlaşma, sakatlık ve artmış mortalite riski dahil olmak üzere kötü hasta sonuçlarına işaret eder. SII’nin yönetimi son derece pahalıdır ve hasta başına 900.000 dolardan fazlaya mal olur7.
Staphylococcus aureus, SII 8,9,10,11’in en yaygın virülan patojenidir. Bakteriler donanımı doğrudan ameliyat sırasında, ameliyat sonrası dönemde yaradan veya daha sonra hematojen yayılma yoluyla tohumlayabilir. Metal implantların varlığında, S. aureus, bakterileri antibiyotik tedavisinden ve bağışıklık hücrelerinden koruyan biyofilm oluşturur. Enfekte olmuş donanımın çıkarılması bir enfeksiyonun etkili bir şekilde ortadan kaldırılmasına yardımcı olabilirken, bu genellikle omurgada istikrarsızlığa neden olmadan ve nörolojik uzlaşma riski taşımadanmümkün değildir 12.
Enfekte olmuş donanımın ekstrüktüre edilmemesi durumunda, SII’yi önlemek, tespit etmek ve tedavi etmek için yeni yaklaşımlara ihtiyaç vardır. Tarihsel olarak, yeni tedavilerin güvenliğini ve etkinliğini etkin bir şekilde değerlendirmek için SII’nin sınırlı hayvan modelleri olmuştur. SII’nin önceki hayvan modelleri, çok sayıda hayvan ve koloni sayımı, histoloji ve kültür dahil olmak üzere ötenazi gerektiren veri noktalarının toplanmasını gerektirir13,14,15. Uzunlamasına in vivo izlemeden yoksun olan bu modeller, hayvan başına yalnızca bir veri noktası sağlar ve bu nedenle pahalı ve verimsizdir.
Diz artroplastisi enfeksiyonunun bir fare modelini inceleyen önceki çalışma, enfeksiyon yükünü uzunlamasına izlemek için noninvaziv in vivo optik görüntülemenin değerini ve doğruluğunu ortaya koymuştur16. Biyolüminesansın tespiti, bakteri yükünün tek bir hayvanda uzunlamasına bir zaman boyunca insanca, doğru ve verimli bir şekilde ölçülmesini sağlar. Ayrıca, önceki çalışmalar, in vivo biyolüminesans ile implantlara bağlı CFU’lar arasında yüksek bir korelasyon olduğunu göstermiştir17. Zaman içinde enfeksiyonu takip etme kapasitesi, implantla ilişkili enfeksiyonun daha incelikli bir şekilde anlaşılmasına yol açmıştır. Ek olarak, boylamsal enfeksiyonun bu şekilde izlenmesi, antibiyotik tedavisinin ve yeni antimikrobiyallerin etkinliğinin doğru bir şekilde değerlendirilmesine olanak sağlamıştır16,17,18.
Bu araçlardan yararlanarak, postoperatif spinal implant enfeksiyonu modelini geliştirdik ve doğruladık. Sunulan yöntemde, bakteri yükünü uzunlamasına izlemek için SII’nin in vivo fare modelini oluşturmak için bir biyolüminesan S. aureus Xen36 aşısı kullanıyoruz16,17,18. Bu yeni model, daha büyük hayvan modellerinde ve klinik çalışmalarda uygulanmadan önce SII için potansiyel tespit, önleme ve tedavi stratejilerini verimli bir şekilde test etmek için değerli bir araç sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Omurgadaki implantla ilişkili enfeksiyonlar, 1,2,3,4,5 hastaları için kötü sonuçlara işaret eder. Vücuttaki diğer birçok bölgeden farklı olarak, omurgadaki enfekte donanım, instabilite ve nörolojik uzlaşma riski nedeniyle sıklıkla çıkarılamaz. Sistemik antibiyotik tedavisine dirençli biyofilm bakterileri ortamındaki bu benzersiz zorluk, t…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, hem Kuzey Amerika Pediatrik Ortopedi Derneği Biomet Omurga Hibesi hem de Ulusal Sağlık Enstitüleri Klinik ve Translasyonel Bilim Enstitüsü KL2 Hibesi ve HH Lee Cerrahi Araştırma Hibesi’nin bu deneyler için ana finansman kaynakları olarak alındığını kabul etmek istemektedir.
Materials
| Analytical Balance ME104 | Mettler Toledo | 30029067 | 120 g capacity, 0.1 mg readability, backlit LCD, internal adjustment, metal base |
| BD Bacto Tryptic Soy Broth | Becton Dickinson (BD) | BD 211825 | BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium) |
| Biomate 3S UV-VIS Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-208300 | Spectrophotometer; Thermo Scientific; BioMate 3S; Six-position cell holder; Spectral bandwidth: 1.8nm; Long-life xenon lamp; Store up to 40 test methods; 16L x 13W x 9 in. H; 19 lb.; 100/240V US line cord |
| Bioshield 720+ swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 75003183 | Rotor, Swinging bucket; Thermo Scientific; BIOShield 720 high speed; Capacity: 4 x 180mL (0.72L); Angle: 90 deg. ; Max. speed/RCF: 6300rpm/7188 x g; Max. radius: 16.2cm |
| Branson Ultrasonics 2510R-MTH (Sonicator) | Branson Ultrasonics | CPX952217R | *similar model, our model is discontinued* Branson Ultrasonics MH Series Heated Ultrasonic Cleaning Bath, 120V, 0.75 gal |
| Bullet Blender Storm Homogenizer | Next Advance | BBY24M | The Bullet Blender Storm is the most powerful member of the Bullet Blender family. Homogenize up to 24 of your toughest samples (mouse femur, skin, cartilage, tumor, etc.) in just minutes. Air cooling™ minimizes sample heat up. Uses 1.5ml screw-cap RINO® tubes or snap-cap Eppendorf® Safe-lock™ tubes. |
| Germinator 500 | Electron Microscopy Sciences | 66118-10 | The Germinator 500 is designed to decontaminate metal micro-dissecting instruments only. It is to be used exclusively for research purposes. The Germinator 500 should not be used as a substitute for traditional methods of terminal sterilization. Effective sterilization cannot be assured due to lack of routine sterilization-efficacy monitoring methods for glass bead sterilization. The Germinator 500 has been designed and built to pass the Validation of Dry Sterilizer Spore Suspension Test: USP XXIII, Part 1211. |
| Heracell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | Single 150L |
| IVIS Lumina X5 Imaging System | Perkin Elmer | CLS148590 | The IVIS Lumina X5 high-throughput 2D optical imaging system combines high-sensitivity bioluminescence and fluorescence with high-resolution x-ray into a compact system that fits on your benchtop. With an expanded 5 mouse field of view for 2D optical imaging plus our unique line of accessories to accelerate setup and labeling, it has never been easier or faster to get robust data—and answers—on anatomical and molecular aspects of disease. |
| MAXQ 4450 Digtial Incubating Bench Shaker | Thermo Scientific | SHKE4450 | Shaker, Incubated; Thermo Scientific; Digital; MaxQ 4450; Speed 15 to 500rpm +/-1rpm; 5 deg. C above ambient to 80 deg. C; 120V 50/60Hz |
| PBS, Phosphate Buffered Saline | Fisher Bioreagents | BP24384 | PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4 |
| Sorvall Legend Micro 21 Centrifuge, Ventilated | Thermo Scientific | 75002436 | 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal biocontainment lid |
| SORVALL LEGEND X1R 120V Centrifuge | Thermo Scientific | 75004261 | Centrifuge, Benchtop; Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R (Refrigerated), 1L capacity; Max. Speed/RCF 15,200rpm/25,830 x g; CFC-free cooling -10C to +40C; 120V 60Hz |
| Staphylococcus aureus – Xen36 | Perkin Elmer | 119243 | Staphylococcus aureus – Xen36 bioluminescent pathogenic bacteria for in vivo and in vitro drug discovery. This product was derived from a parental strain from the American Type Culture Collection, used under license. Staph. aureus-Xen36 possesses a stable copy of the Photorhabdus luminescens lux operon on the native plasmid. |
| TUTTNAUER AUTOCLAVE 2540E 120V | Heidolph Tuttnauer | 23210401 | Sterilizer, Benchtop; Heidolph; Tuttnauer; Model 2540E; Self-contained design with refillable reservoir controls water purity for sterilization; 120V 50/60Hz; 1400w. With electronic controls |
| Tween 80 | Fisher Bioreagents | BP338-500 | Tween 80, Fisher BioReagents, Non-ionic detergent for selective protein extraction |
| Vortex mixer VX-200 | Labnet Internation | S0200 | 120V touch or continuous mixer, 230V: 0 – 2,850 rpm,120V: 0 – 3,400 rpm |
| 0.9% Sodium Chloride | Pfizer Injectables/Hospira | 00409-4888-10 | 0.9% Sodium Chloride Injection, USP |
Referências
- Verdrengh, M., Tarkowski, A. Role of neutrophils in experimental septicemia and septic arthritis induced by Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 65 (7), 2517-2521 (1997).
- Fang, A., Hu, S. S., Endres, N., Bradford, D. S. Risk factors for infection after spinal surgery. Spine. 30 (12), 1460-1465 (2005).
- Levi, A. D., Dickman, C. A., Sonntag, V. K. Management of postoperative infections after spinal instrumentation. Journal of Neurosurgery. 86 (6), 975-980 (1997).
- Weinstein, M. A., McCabe, J. P., Cammisa, F. P. Postoperative spinal wound infection: a review of 2,391 consecutive index procedures. Journal of Spinal Disorders. 13 (5), 422-426 (2000).
- Picada, R., et al. Postoperative deep wound infection in adults after posterior lumbosacral spine fusion with instrumentation: incidence and management. Journal of Spinal Disorders. 13 (1), 42-45 (2000).
- Smith, J. S., et al. Rates of infection after spine surgery based on 108,419 procedures: a report from the Scoliosis Research Society Morbidity and Mortality Committee. Spine. 36 (7), 556-563 (2011).
- Abbey, D. M., Turner, D. M., Warson, J. S., Wirt, T. C., Scalley, R. D. Treatment of postoperative wound infections following spinal fusion with instrumentation. Journal of Spinal Disorders. 8 (4), 278-283 (1995).
- Silber, J. S., et al. Management of postprocedural discitis. Spine Journal. 2 (4), 279-287 (2002).
- Pappou, I. P., Papadopoulos, E. C., Sama, A. A., Girardi, F. P., Cammisa, F. P. Postoperative infections in interbody fusion for degenerative spinal disease. Clinical Orthopaedics and Related Research. 444, 120-128 (2006).
- Sampedro, M. F., et al. A biofilm approach to detect bacteria on removed spinal implants. Spine. 35 (12), 1218-1224 (2010).
- Pull ter Gunne, A. F., Mohamed, A. S., Skolasky, R. L., van Laarhoven, C. J., Cohen, D. B. The presentation, incidence, etiology, and treatment of surgical site infections after spinal surgery. Spine. 35 (13), 1323-1328 (2010).
- Olsen, M. A., et al. Risk factors for surgical site infection in spinal surgery. Journal of Neurosurgery. 98, 149-155 (2003).
- Ofluoglu, E. A., et al. Implant-related infection model in rat spine. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 127 (5), 391-396 (2007).
- Guiboux, J. P., et al. The role of prophylactic antibiotics in spinal instrumentation. A rabbit model. Spine. 23 (6), 653-656 (1998).
- Stavrakis, A. I., et al. Current Animal Models of Postoperative Spine Infection and Potential Future Advances. Frontiers in Medicine (Lausanne). 2, 34 (2015).
- Pribaz, J. R., et al. Mouse model of chronic post-arthroplasty infection: noninvasive in vivo bioluminescence imaging to monitor bacterial burden for long-term study. Journal of Orthopaedic Research. 30 (3), 335-340 (2012).
- Bernthal, N. M., et al. A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings. PLoS One. 5 (9), 12580 (2010).
- Niska, J. A., et al. Monitoring bacterial burden, inflammation and bone damage longitudinally using optical and muCT imaging in an orthopaedic implant infection in mice. PLoS One. 7 (10), 47397 (2012).
- Francis, K. P., et al. Monitoring bioluminescent Staphylococcus aureus infections in living mice using a novel luxABCDE construct. Infection and Immunity. 68 (6), 3594-3600 (2000).
- Dworsky, E. M., et al. Novel in vivo mouse model of implant related spine infection. Journal of Orthopaedic Research. 35 (1), 193-199 (2017).
- Hegde, S. S., et al. Activity of telavancin against heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus (hVISA) in vitro and in an in vivo mouse model of bacteraemia. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 65 (4), 725-728 (2010).
- Crandon, J. L., Kuti, J. L., Nicolau, D. P. Comparative efficacies of human simulated exposures of telavancin and vancomycin against methicillin-resistant Staphylococcus aureus with a range of vancomycin MICs in a murine pneumonia model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54 (12), 5115-5119 (2010).
- Reyes, N., et al. Efficacy of telavancin in a murine model of bacteraemia induced by methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 58 (2), 462-465 (2006).
- Sakoulas, G., Eliopoulos, G. M., Alder, J., Eliopoulos, C. T. Efficacy of daptomycin in experimental endocarditis due to methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (5), 1714-1718 (2003).
- Hu, Y., et al. Combinatory antibiotic therapy increases rate of bacterial kill but not final outcome in a novel mouse model of Staphylococcus aureus spinal implant infection. PLoS One. 12 (2), 0173019 (2017).
- Poelstra, K. A., Barekzi, N. A., Grainger, D. W., Gristina, A. G., Schuler, T. C. A novel spinal implant infection model in rabbits. Spine. 25 (4), 406-410 (2000).
