NF-κB-afhængig luciferase aktivering og kvantificering af genekspression i salmonella inficerede vævskultur celler

Summary

Her præsenterer vi en protokol til hurtigt og nemt at måle nuklear faktor Kappa-lys-kæde forstærker af aktiverede B-celler (NF-κB) aktivering i cellelinjer, der udtrykker NF-κB:: luciferase reporter konstruerer, via målinger af luminescens i celle lysatet. Desuden bestemmes genekspression via RT-qPCR isoleret fra celler inficeret med salmonella typhimurium.

Abstract

Den dikemeje transkriptionsfaktoren NF-κB regulerer mange cellulære respons veje, herunder inflammatoriske veje ved at inducere ekspression af forskellige cytokiner og kemo okiner. NF-κb er konstitutivt udtrykt og er afsondret i cytosol af den hæmmende protein nukleare faktor af Kappa Light polypeptid gene forstærker i B-celle inhibitor, alpha (iκbα). Aktivering af NF-κB kræver nedbrydning af IκBα, som derefter udsætter et nukleart lokaliserings signal på NF-κB og fremmer sin handel med kernen. Når i kernen, NF-κB binder sig til promotor regionen af NF-κB Target gener såsom interleukin 6 (IL-6) og IL-23, at fremme deres udtryk.

Aktivering af NF-κB sker uafhængigt af transskription eller oversættelse. Derfor skal tilstanden for aktivering af NF-κB måles enten ved at kvantificere NF-κB specifikt i kernen eller ved at kvantificere ekspression af NF-κB-målgener. I denne protokol, celler stabilt transficeret med en NF-κb:: luciferase reporter konstruere er analyseret for NF-κb aktivering ved hjælp af in vitro vævskultur teknikker. Disse celler er inficeret med salmonella typhimurium at aktivere NF-κb, som trafiker til kernen og binder sig til κb sites i arrangøren regionen luciferase, inducerende sit udtryk. Cellerne lyseres og analyseres med der-analysesystemet. Mængden af der produceret af cellerne korrelerer med intensiteten af luminescens signalet, som detekteres af en plade læser. Luminescens signalet genereret af denne procedure giver en hurtig og meget følsom metode til at vurdere NF-κB aktivering under en række betingelser. Denne protokol anvender også kvantitativ reverse transkription PCR (RT-qPCR) til at detektere relative mRNA-niveauer, der er tegn på genekspression.

Introduction

Den nukleare faktor-κB (NF-κB) familie af proteiner er vigtige transskription aktivatorer, der regulerer genekspression i forskellige biologiske veje. Aktivering af NF-κb inducerer transkriptionen af målgener, hvoraf mange er vigtige for immun-og inflammatoriske reaktioner, celle spredning, stress respons og cancer progression^1,2. NF-κB spiller en integrerende rolle i at mæere tidlige inflammatoriske resultater for patogenclearance. I betragtning af de mange biologiske processer medieret af NF-κB aktivering, afbrydelser i sin signalering kan have alvorlige konsekvenser for sundhed og sygdom. Tab af funktion mutationer i NF-κB signalering er forbundet i flere immundefekt fænotyper, mens gevinst af funktion mutationer er forbundet med flere typer af kræft, herunder B-celle lymfomer og brystkræft³. Desuden, mange patogener har vist sig at direkte moduere aktivering tilstand af NF-κb gennem ekspression af virulensfaktorer^4,5,6,7.

Aktivering af NF-κB er kendt for at være en konsekvens af mange variable stimuli, herunder bakterielle produkter såsom lipopolysaccharider (LPS), flagellin og peptidoglycans kendt som patogen-associerede molekylære mønstre (pamper). Disse brochurer opdages ved mønstergenkendelse receptorer (PRRs) såsom bompenge-lignende receptorer (TLRs) og NOD-lignende receptorer (NLRs) fører til aktivering af NF-κB og den efterfølgende ekspression af en matrix af NF-κB-afhængige inflammatoriske gener⁸. Ud over at PRR aktivering af Pamler, andre bakterie produkter, såsom bakterielle Effector proteiner, kan inducere aktivering af NF-κB. Interessant, bakterier også udtrykke Effector proteiner, der aktivt dæmpe NF-κB pathway og forbedre deres patogenicitet, understreger betydningen af NF-κB som en væsentlig mægler af immunitet⁹.

Der er fem forskellige under enheder, der udgør NF-κB-dimere; P50, P52, RelA (P65), RelB og cRel. De to vigtigste NF-κB Heterodimere er P50: RelA og P52: RelB dimers. De aktiverede NF-κb dimerer binder sig til DNA-steder, kendt som κb-lokaliteter, i arrangøren og forstærker-regionerne i forskellige målgener. Under normale homeostatiske forhold interagerer NF-κB med en familie af inhibitorer, der kaldes IκB-proteiner, for at forblive inaktive. Ved stimulering fosforyleres IκB af IκB kinase (IKK), som gør det muligt at være målrettet mod allestedsnærværende og efterfølgende nedbrydning. Nedbrydning af IκB aktiverer NF-κB ved at afsløre et nukleart lokaliserings signal. NF-κB omfordeler derefter til kernen, hvor den binder κB-lokaliteter i arrangøren-området af Target-gener og fremmer transkriptionen¹⁰. Således aktivering af NF-κb opregulerer mRNA ekspression af NF-κb Target gener, og denne ændring kan måles gennem RNA kvantificering assays såsom rt-qPCR¹¹.

Der findes flere metoder, som almindeligvis anvendes til måling af aktivering af NF-κB, herunder elektroforetiske mobilitets Skift assays (EMSA), nuklear translokation og gen reporter assays. EMSA anvendes til påvisning af protein komplekser med nukleinsyrer. Stimulerede celler fraktioneres for at isolere nukleare proteiner, herunder den translokeres NF-κb, som derefter inkuberet med radioaktivt mærkede nukleotider, der indeholder NF-κb-bindings domænet. Prøverne køres på en gel og afbildet af Autoradiografi af ³²P-mærket nukleinsyre. Hvis NF-κB er til stede i proteinfraktionen, vil det binde nucleotider, som vil migrere langsommere gennem gelen og præsentere som diskrete bands. Nukleare fraktioner af celler, der mangler aktiveret NF-κB (f. eks. ustimulerede kontrol celler), vil ikke producere nogen bånd, da nucleotider migrerer hurtigere til enden af gelen. En væsentlig ulempe ved denne metode er, at den stort set er kvantitativ i binær forstand (dvs. til eller fra) og ikke i tilstrækkelig grad indfanger meningsfulde forskelle i NF-κB-bindings kapacitet. Desuden er denne metode ikke overveje kromatin strukturer, der er funktionelt vigtige for NF-κb Target gener^12,13.

På samme måde som den foregående metode er der en “non-Shift”-analyse, hvor multi-brønd plader er belagt med nukleotider, der indeholder en NF-κB-bindings sekvens. Efter behandling af celler med nukleare fraktioner af protein, NF-κB vil binde til nucleotider bundet til brønden. Anti-NF-κB antistoffer tilsættes derefter, som vil interagere med den bundne NF-κB og producere et kolorimetrisk signal proportional med mængden af NF-κB, hvilket indikerer graden af NF-κB aktivering. Denne metode er fordelagtig i forhold til EMSA, idet den ikke kræver radioaktivt mærkede nukleinsyre og er kvantitativ i sammenligning. Men, en advarsel af denne metode er, at det igen ikke skelner mellem kromatin stater af NF-κB mål gener¹⁴.

En anden metode, hvormed NF-κB aktivering kan påvises, er ved kromatin immunopræcipitation (ChIP), hvorved DNA og interagere proteiner er kryds forbundet med formaldehyd og immunoprecipitated med specifikke anti-NF-κB antistoffer. De specifikke nukleotidfragmenter renses og identificeres derefter gennem PCR amplifikation eller direkte High gennemløb Sequencing. Resultater genereret fra denne metode giver semi-kvantitative resultater af NF-κB binding aktivitet med Target gener. Resultaterne er imidlertid meget afhængige af fikserings forholdene og rensnings processerne ved hvert trin¹⁵.

I nukleare translokation assays stimuleres cellerne til at inducere NF-κB aktivering og derefter fast. Anti-P65-antistoffer tilsættes til faste celler. Alternativt kan P65-under enheden selv mærkes med et fluorescerende peptid, såsom grønt fluorescerende grønt (GFP). I begge tilfælde vil immunofluorescens gøre det muligt at billed lokalisering af P65 for at bestemme cellulær distribution. Ved at måle andelen af cytosolisk og nukleare lokaliseret protein, kan investigatorerne bestemme den relative aktiveringstilstand af NF-κb. En ulempe ved denne metode er, at immunofluorescens er forholdsvis tidskrævende, kræver dyre antistoffer, og har brug for relativt større teknisk ekspertise¹⁶.

Reporter gener er almindeligt anvendte værktøjer til at studere de regulatoriske og udtryks mønstre af et gen af interesse. Typisk er reporter gener konstrueret fra arrangøren sekvens af et gen af interesse smeltet til et gen kodning for en let detekterbar protein. Proteiner med enzymatiske aktiviteter, fluorescens eller luminescens egenskaber er almindeligt valgt for deres evne til at blive analyseret og kvantificeret. Således fungerer udlæsning (f. eks. luminescens, fluorescens) som et signal til påvisning af genekspression. Disse reporter konstruktioner kan derefter indføres i forskellige celletyper, såsom epiteliale celler eller makrofager.

Beskrevet i protokollen er brugen af en klonet Hela Cell line (Hela 57a), der er stabilt transficeret med en der reporter, der indeholder tre eksemplarer af κb konsensus af immunglobulin κ-Chain Promoter region¹⁷. Ekspression af der er afhængig af aktivering af NF-κb, som opstår efter celle stimulation. Stimulerede celler let lyseres ved hjælp af cellelyse buffer leveres i der assay kit. En del af celle lysatet blandes derefter med der assay buffer, der indeholder luciferin. Luciferin er underlaget for der og er nødvendig for generering af lys i nærværelse af der. Efter at have kombineret analyse bufferen med lysbilledet udsender opløsningen lys i en proces, der kaldes luminescens. Mængden af produceret lys, givet i lumen, er proportional med mængden af der til stede i lysatet og tjener som et mål for NF-κb aktivering. Lumen aflæsninger fortolkes i forhold til en ustimuleret standard til at tage højde for baseline NF-κB aktivitet og selve signalet er stabilt i flere minutter for at give mulighed for pålidelig måling. Desuden er den Hela 57a cellelinje stabilt transficeret med en NF-κb-uafhængig β-galactosidase reporter. Β-galactosidase-indberetteren udtrykkes konstitutivt, og β-galactosidaseaktivitet kan måles til kontrol af cellernes levedygtighed eller variation i celle numrene¹⁷. Luciferaseværdierne kan derefter justeres til β-galactosidaseværdierne og rapporteres som fold stigning over de ustimulerede kontrol celler.

Da NF-κB er en transkriptionsfaktor, der er ansvarlig for det øgede ekspression af NF-κB-afhængige målgener, er et opfølgende eksperiment til kontrol for NF-κB-afhængig øget genekspression kvantitativ reverse transkription polymerase kædereaktion ( RT-qPCR). RT-qPCR er en meget følsom metode, hvormed ændringer i genekspression kan kvantificeres over flere størrelsesordener. Stimuleret og kontrol celler høstes for RNA via phenol-chloroform ekstraktion. Efter faseadskillelse udvindes RNA som den vigtigste bestanddel af det vandige lag. RNA udfældede derefter og vaskes for at producere en ren pellet. Denne pellet er derefter rekonstitueret og yderligere renset for kontaminerende DNA via DNase behandling. Den rene RNA er derefter omvendt transskriberet til at skabe komplementære DNA (cDNA). Dette cDNA kan derefter analyseres ved hjælp af kvantitative PCR-teknikker, hvor den overflod af en specifik mRNA-sekvens kvantificeres for at bestemme genekspression. Denne teknik ikke belyse Translationel kontrol, post translationel modifikation, protein overflod, eller protein aktivitet. Men, mange gener, især dem, der er involveret i pro-inflammatoriske processer, reguleres via NF-κB og deres mRNA overflod er vejledende for deres udtryk.

Den metode, der foreslås her udnytter en hurtig og enkel måde, hvorpå NF-κB aktivering kan påvises via luminescens assays af cellulære lysate. RT-qPCR af NF-κB Target genekspression kan bruges til at kvantificere ekspression af bestemte gener, samt validere funktionel aktivitet af NF-κB aktivering. De store fordele ved et sådant system er dets enkelhed og hastighed, som giver mulighed for høj gennemløbs screening af en række betingelser, der modutere NF-κB aktivering. Denne protokol er egnet til andre cellelinjer, der udtrykker en NF-κb:: luciferase reporter, og er blevet demonstreret i stabilt transficeret RAW 264.7 celler¹⁸. Mængden af tid, der kræves til at håndtere prøver, startende fra celle lysis til at generere et luminescens signal, er minimal og tager spændvidden på omkring en time. Måling af NF-κB kræver kun grundlæggende laboratorieudstyr såsom uigennemsigtige plader, en plade læser, der er i stand til at måle luminescens, og enkel dataanalyse software såsom et regnearksprogram.

Protocol

1. celle Passaging og såning Der opretholdes HeLa 57A-celler i en 75 cm2 -kolbe indeholdende 10 ml dulbecco’s modificerede eagle’s Media (DMEM) suppleret med 5% varme inaktiveret føtal bovint serum (FBS) ved 37 °c i en 5% Co2 -inkubator. Aspirer cellekultur medier, og vask med 1 mL 0,05% trypsin-EDTA-opløsning. Indsug trypsin, og Udskift den med yderligere 1 mL. Kolben anbringes i en 37 °C-inkubator i 4-5 min, så cellerne kan løsne sig fra kolben. Tilsæt 9 mL ce…

Representative Results

Den analyse, der er beskrevet her, fokuserer på aktivering af transkriptionsfaktoren NF-κb ved hjælp af en NF-κb-afhængig der-reporter, som er stabilt transficeret til en linje af Hela-celler. Aktiveret NF-κB omfordeler sig til kernen, hvor det binder κB bindingssteder af målgener, herunder de pro-inflammatoriske cytokiner IL6 og IL23. En generel oversigt over NF-κB aktivering er afbildet i figur 1. Den gramnegative bakterie Sal…

Discussion

Det vigtigste bidrag af den beskrevne protokol er, at det giver en hurtig og nem metode til at detektere NF-κB aktivering i celler, som giver mulighed for høj gennemløbs analyse af flere stimulerende betingelser eller lægemidler, der påvirker NF-κB aktivering. Her beskriver vi en protokol for NF-κB aktivering i salmonella-inficerede Hela celler. Disse celler kan bruges til infektion med andre patogener samt at studere virkningen af bakteriel infektion på NF-κB aktivering. Desuden, NF-κb-afhængige der …

Materials

Adhesive film	VWR International	60941-070
chloroform	Fisher Bioreagents	C298-500
DMEM	Thermo Fisher	11665092
DNAse treatment kit	Qiagen	79254
dNTPs	Promega	U1511
ethanol	Fisher Bioreagents	BP2818100	molecular grade
FBS	Sigma-Aldrich	F0926
HeLa 57A cells			Ref # 15
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4368814
isopropanol	Fisher Bioreagents	BP26181
Kanamycin	Fisher Bioreagents	BP906-5
LB agar	Fisher Bioreagents	BP1425-500
Lysogeny broth	Fisher Bioreagents	BP1426-500
MgCl2	Fisher Chemical
NanoDrop ND-1000	Thermo Scientific		spectrophotometer
promega luciferase assay system	Promega	E1501	Cell lysis buffer & luciferin substrate
Random Hexamers	Thermo Scientific	SO142
Real-time GAPDH forward primer			5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC AAAGT-3'
Real-time GAPDH reverse primer			5-'CCCACTCCTCCACCT TTGAC-3'
Real-time IL-23 forward primer			5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC TGAT-3'
Real-time IL-23 reverse primer			5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3'
Real-time IL-6 forward primer			5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3'
Real-time IL-6 reverse primer			5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG GCTG-3'
Reverse Transcriptase	Applied Biosystems	4308228
RNAse inhibitor	Thermo Scientific	EO0381
RT buffer	Promega	A3561
SL1344			Ref # 17
SL1344 ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039			Ref # 18
SL1344 ΔsopE ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039			Ref # 18
SYBR green	Applied Biosystems	4309155	2x mastermix
Tri-reagent	Molecular Research Center	TR 118	guanidine thiocyanate
Trypsin -EDTA	Thermo Fisher	25300054	0.05% Trypsin-EDTA
ultrapure water	Fisher Bioreagents	BP248450
Well plate for PCR	VWR International	89218-294	384-well plate