Activation et quantification de l'expression génique dans les cellules de culture tissulaire infectées par Salmonella

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour mesurer rapidement et facilement le facteur nucléaire kappa-light-chain-enhancer des cellules B activées (NF-B) activation dans les lignées cellulaires exprimant NF-B::luciferase reporter construit, via des mesures de la luminescence dans le lysate cellulaire. En outre, l’expression génique est déterminée par RT-qPCR isolé à partir de cellules infectées par Salmonella Typhimurium.

Abstract

Le facteur de transcription dimérique NF-B régule beaucoup de voies de réponse cellulaire, y compris des voies inflammatoires en induisant l’expression de diverses cytokines et chemokines. Le NF-B est exprimé de façon constitutive et est séquestré dans le cytosol par le facteur nucléaire de protéine inhibitrice de l’améliorateur de gène polypeptide léger de kappa dans l’inhibiteur de cellules B, alpha (IBMD). L’activation de la NF-B nécessite la dégradation de l’I-B, qui expose ensuite un signal de localisation nucléaire sur NF-B et favorise son trafic vers le noyau. Une fois dans le noyau, nf-B se lie à la région promotrice des gènes cibles NF-B tels que l’interleukine 6 (IL-6) et l’IL-23, pour promouvoir leur expression.

L’activation de NF-B se fait indépendamment de la transcription ou de la traduction. Par conséquent, l’état d’activation de NF-B doit être mesuré soit en quantifiant le NF-B spécifiquement dans le noyau, soit en quantifiant l’expression des gènes cibles NF-B. Dans ce protocole, les cellules poignardées transfectées avec un NF-B::luciferase reporter construction sont astomisés pour l’activation NF-B en utilisant des techniques de culture tissulaire in vitro. Ces cellules sont infectées par Salmonella Typhimurium pour activer le NF-B, qui se connecte au noyau et se lie aux sites De B dans la région de promoteur de la luciferase, induisant son expression. Les cellules sont lysées et analysées avec le système d’analyse de la luciferase. La quantité de luciferase produite par les cellules est en corrélation avec l’intensité du signal de luminescence, qui est détecté par un lecteur de plaque. Le signal de luminescence généré par cette procédure fournit une méthode rapide et très sensible pour évaluer l’activation nf-B dans une gamme de conditions. Ce protocole utilise également la transcription inverse quantitative PCR (RT-qPCR) pour détecter les niveaux relatifs d’ARNm qui sont indicatifs de l’expression de gène.

Introduction

La famille de protéines de facteur nucléaire (NF-B) est d’importants activateurs de transcription qui régulent l’expression des gènes dans diverses voies biologiques. L’activation de NF-B induit la transcription des gènes cibles, dont beaucoup sont importants pour les réponses immunitaires et inflammatoires, la prolifération cellulaire, les réponses au stress et la progression du cancer^1,2. Le NF-B joue un rôle intégral dans la médiation des résultats inflammatoires précoces pour le dégagement d’agent pathogène. Étant donné les nombreux processus biologiques médiés par l’activation de la NF-B, les perturbations de sa signalisation peuvent avoir de graves conséquences sur la santé et la maladie. La perte des mutations de fonction dans la signalisation de NF-B sont associées dans plusieurs phénotypes d’insuffisance immunitaire, alors que le gain des mutations de fonction sont associés à plusieurs types de cancers, y compris les lymphomes de B-cellule et les cancers du sein^3. En outre, de nombreux agents pathogènes ont été montrés pour moduler directement l’état d’activation de NF-B par l’expression des facteurs de virulence^4,5,6,7.

L’activation de NF-B est connue pour être une conséquence de beaucoup de stimulus variables comprenant des produits bactériens tels que des lipopolysaccharides (LPS), de flagellin et de peptidoglycans connus sous le nom de modèles moléculaires pathogène-associés (PAMPs). Ces PAMP sont détectés par des récepteurs de reconnaissance de modèles (PRR) tels que les récepteurs de type Toll (TLR) et les récepteurs de type Nod (NLR) conduisant à l’activation de NF-B et à l’expression subséquente d’un éventail de gènes inflammatoires NF-B-dépendants⁸. En plus de l’activation prR par les PPM, d’autres produits bactériens, tels que les protéines effecteurs bactériens, peuvent induire l’activation de NF-B. Il est intéressant de noter que les bactéries expriment également des protéines effectrices qui atténuent activement la voie NF-B et améliorent leur pathogénicité, soulignant l’importance de NF-B en tant que médiateur essentiel de l’immunité⁹.

Il y a cinq sous-unités différentes qui forment les dimers NF-B ; p50, p52, RelA (p65), RelB et cRel. Les deux principaux hétérodistes NF-B sont les p50:RelA et les dimères p52:RelB. Les dimères NF-B activés se lient aux sites d’ADN, connus sous le nom de sites B, dans les régions de promoteur et d’amélioration de divers gènes cibles. Dans des conditions homéostatiques normales, nf-B interagit avec une famille de protéines inhibiteurs connues sous le nom de protéines I-B pour rester inactives. Lors de la stimulation, l’I-B est phosphorylé par I-B Kinase (IKK), ce qui lui permet d’être ciblé pour l’ubiquitination, puis la dégradation. La dégradation de l’I-B active le NF-B en révélant un signal de localisation nucléaire. NF-B se transsitue ensuite au noyau, où il lie les sites B dans la région promoteur des gènes cibles et favorise la transcription¹⁰. Ainsi, l’activation de NF-B upregulates rna expression of NF-B target genes, and this change can be measured through RNA quantification assays such as RT-qPCR¹¹.

Plusieurs méthodes existent et sont couramment utilisées pour la mesure de l’activation NF-B, y compris les essais de changement de mobilité électrophorétique (EMSA), la translocation nucléaire, et les essais de journaliste de gène. EMSA est utilisé pour détecter les complexes protéiques avec des acides nucléiques. Les cellules stimulées sont fractionnées pour isoler les protéines nucléaires, y compris le NF-B translocalisé, qui est ensuite incubé avec des nucléotides radio-étiquetés contenant le domaine de liaison NF-B. Les échantillons sont exécutés sur un gel et représentés par autoradiographie de ³²acide nucléique étiqueté P. Si nf-B est présent dans la fraction de protéine, il liera les nucléotides, qui migreront plus lentement à travers le gel et présenteront comme bandes discrètes. Les fractions nucléaires des cellules dépourvues de NF-B activé (p. ex., les cellules témoins non stimulées) ne produiront aucune bande car les nucléotides migrent plus rapidement vers l’extrémité du gel. Un inconvénient majeur de cette méthode est qu’elle est largement quantitative au sens binaire (c.-à-d., sur ou hors) et ne capture pas adéquatement les différences significatives dans la capacité de liaison NF-B. En outre, cette méthode ne tient pas compte des structures de chromatine qui sont fonctionnellement importantes pour les gènes cibles NF-B^12,13.

Semblable à la méthode précédente, il y a un «non-shift» d’assay dans lequel les plaques multi-puits sont recouvertes de nucléotides contenant la séquence de liaison NF-B. Après le traitement des cellules avec des fractions nucléaires de protéine, NF-B se liera aux nucléotides liés au puits. Des anticorps anti-NF-B sont ensuite ajoutés, qui interagiront avec le NF-B lié et produiront un signal colorimétrique proportionnel à la quantité de NF-B, indiquant le degré d’activation NF-B. Cette méthode est avantageuse par rapport à l’EMSA en ce qu’elle ne nécessite pas d’acides nucléiques radio-étiquetés et est quantitative, en comparaison. Cependant, une mise en garde de cette méthode est qu’elle ne fait pas de différence encore entre les états de chromatine des gènes cibles NF-B¹⁴.

Une autre méthode par laquelle l’activation de NF-B peut être détectée est par l’immunoprécipitation de chromatine (ChIP), par laquelle l’ADN et les protéines interagissant sont croisés avec le formaldéhyde et immunoprécipités avec des anticorps spécifiques d’anti-NF-B. Les fragments spécifiques de nucléotide sont ensuite purifiés et identifiés par amplification de PCR ou séquençage direct de haut débit. Les résultats générés par cette méthode fournissent des résultats semi-quantitatifs de l’activité de liaison NF-B avec les gènes cibles. Cependant, les résultats dépendent fortement des conditions de fixation et des processus de purification à chaque étape¹⁵.

Dans les essais de translocation nucléaire, les cellules sont stimulées pour induire l’activation de NF-B et puis fixées. Des anticorps anti-p65 sont ajoutés aux cellules fixes. Alternativement, la sous-unité p65 elle-même peut être étiquetée avec un peptide fluorescent tel que vert fluorescent vert vert vert (GFP). Dans les deux cas, l’immunofluorescence permettra l’imagerie de la localisation de p65 pour déterminer la distribution cellulaire. En mesurant la proportion de protéines localisées cytosoliques et nucléaires, les chercheurs peuvent déterminer l’état relatif d’activation de nf-B. Un inconvénient de cette méthode est que l’immunofluorescence est comparativement longue, nécessite des anticorps coûteux, et a besoin d’une expertise technique relativement plus grande¹⁶.

Les gènes Reporter sont des outils couramment utilisés pour étudier les modèles de régulation et d’expression d’un gène d’intérêt. Typiquement, les gènes de reporter sont construits à partir de la séquence de promoteur d’un gène d’intérêt fusionné à un code génétique pour une protéine facilement détectable. Les protéines ayant des activités enzymatiques, la fluorescence ou les propriétés de luminescence sont généralement choisies pour leur capacité à être astoyées et quantifiées. Ainsi, la lecture (p. ex. luminescence, fluorescence) sert de signal pour la détection de l’expression du gène. Ces constructions de reporter peuvent alors être introduites dans différents types de cellules, telles que les cellules épithéliales ou les macrophages.

Décrit dans le protocole est l’utilisation d’une lignée cellulaire clonée HeLa (HeLa 57A) qui est poignardée transfectée avec un journaliste de luciferase contenant trois copies du consensus de l’immunoglobuline-chaîne promoteur région¹⁷. L’expression de la luciferase dépend de l’activation de nf-B, qui se produit après stimulation cellulaire. Les cellules stimulées sont facilement lysées à l’aide d’un tampon de lyse cellulaire fourni dans le kit d’assay de la luciferase. Une partie du lysate cellulaire est ensuite mélangée avec un tampon d’épreuve d’assay de luciferase qui contient de la luciférine. Luciferin est le substrat de la luciférase et est nécessaire pour la génération de lumière en présence de la luciférase. Après avoir combiné le tampon d’analyse avec le lysate, la solution émettra de la lumière dans un processus connu sous le nom de luminescence. La quantité de lumière produite, donnée en lumens, est proportionnelle à la quantité de luciferase présente dans le lysate et sert de mesure de l’activation nf-B. Les lectures lumen sont interprétées par rapport à une norme non stimulée pour tenir compte de l’activité de base nf-B et le signal lui-même est stable pendant plusieurs minutes pour permettre une mesure fiable. En outre, la ligne cellulaire HeLa 57A est poignardée transfectée avec un journaliste NF—B-indépendant de galactosidase. Le journaliste de l’a-galactosidase est exprimé de façon constitutive, et l’activité de la galactosidase peut être mesurée pour contrôler la viabilité cellulaire ou la variation des nombres cellulaires¹⁷. Les valeurs de luciférase peuvent alors être ajustées aux valeurs de la galactosidase et signalées à mesure que le pli augmente sur les cellules témoins non stimulées.

Étant donné que nf-B est un facteur de transcription responsable de l’expression accrue des gènes cibles dépendants de NF-B, une expérience de suivi pour contrôler l’expression accrue de nf-B-dépend est la réaction quantitative de chaîne de polymériase de transcription inverse ( RT-qPCR). RT-qPCR est une méthode très sensible par laquelle les changements dans l’expression du gène peuvent être quantifiés sur plusieurs ordres de grandeur. Les cellules stimulées et témoins sont récoltées pour l’ARN par extraction de phénol-chloroforme. Après la séparation de phase, l’ARN est extrait comme composant principal de la couche aqueuse. L’ARN est ensuite précipité et lavé pour produire une boulette pure. Cette pastille est ensuite reconstituée et nettoyée de l’ADN contaminant par le traitement DNase. L’ARN pur est ensuite transcrit à l’envers pour créer de l’ADN complémentaire (ADNc). Cet ADNc peut ensuite être analysé par des techniques quantitatives de PCR, où l’abondance d’une séquence spécifique d’ARNm est quantifiée pour déterminer l’expression de gène. Cette technique n’élucide pas le contrôle translationnel, la modification post-traductionnelle, l’abondance des protéines ou l’activité protéique. Cependant, beaucoup de gènes, particulièrement ceux impliqués dans des processus pro-inflammatoires, sont réglés par l’intermédiaire de NF-B et leur abondance d’ARNm est indicative de leur expression.

La méthode proposée ici utilise une façon rapide et simple par laquelle l’activation NF-B peut être détectée par des essais de luminescence du lysate cellulaire. Rt-qPCR de l’expression du gène cible NF-B peut être utilisé pour quantifier l’expression de gènes particuliers, ainsi que pour valider l’activité fonctionnelle de l’activation NF-B. Les principaux avantages d’un tel système sont sa simplicité et sa vitesse, ce qui permet un contrôle à haut débit d’une gamme de conditions qui modulent l’activation NF-B. Ce protocole convient à d’autres lignées cellulaires exprimant un NF-B::luciferase journaliste, et a été démontré dans les cellules RAW264.7 transfectés poignardant¹⁸. Le temps nécessaire pour traiter les échantillons, à partir de la lyse cellulaire à la génération d’un signal de luminescence, est minime et prend la durée d’environ une heure. La mesure de NF-B ne nécessite que des équipements de laboratoire de base tels que des plaques opaques, un lecteur de plaques capable de mesurer la luminescence, et un logiciel simple d’analyse de données comme un programme de feuilles de calcul.

Protocol

1. Passaging et ensemencement de cellules Maintenir les cellules HeLa 57A dans un flacon de 75 cm2 contenant 10 ml de la médie d’Aigle modifiée de Dulbecco (DMEM) complétée par un sérum bovin fœtal inactivé à 5 % (SGF) à 37 oC dans un incubateur de CO2 de 5 %. Aspiratez les médias de culture cellulaire et lavez-vous avec 1 ml de la solution trypsin-EDTA de 0,05 %. Aspirez la trypsine et remplacez-la par 1 ml supplémentaire. Placer le flacon dans un incubateur de 37 oC …

Representative Results

Le soute décrit ici se concentre sur l’activation du facteur de transcription NF-B à l’aide d’un journaliste de luciferase NF-B-dépendant qui est poignardétranscé dans une ligne de cellules HeLa. Le NF-B activé se transloque au noyau où il lie les sites de liaison de B des gènes cibles, y compris les cytokines pro-inflammatoires IL6 et IL23. Un aperçu général de l’activation NF-B est représenté à la figure 1. La bactérie gram-…

Discussion

La principale contribution du protocole décrit est qu’il fournit une méthode rapide et facile pour détecter l’activation NF-B dans les cellules, ce qui permet une analyse à haut débit de multiples conditions de stimulation ou de médicaments affectant l’activation NF-B. Ici, nous décrivons un protocole pour l’activation de NF-B dansles cellules De Lal Salmonella-infectées. Ces cellules peuvent être utilisées pour l’infection par d’autres agents pathogènes ainsi pour étudier l’impact de l’infection bac…

Materials

Adhesive film	VWR International	60941-070
chloroform	Fisher Bioreagents	C298-500
DMEM	Thermo Fisher	11665092
DNAse treatment kit	Qiagen	79254
dNTPs	Promega	U1511
ethanol	Fisher Bioreagents	BP2818100	molecular grade
FBS	Sigma-Aldrich	F0926
HeLa 57A cells			Ref # 15
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4368814
isopropanol	Fisher Bioreagents	BP26181
Kanamycin	Fisher Bioreagents	BP906-5
LB agar	Fisher Bioreagents	BP1425-500
Lysogeny broth	Fisher Bioreagents	BP1426-500
MgCl2	Fisher Chemical
NanoDrop ND-1000	Thermo Scientific		spectrophotometer
promega luciferase assay system	Promega	E1501	Cell lysis buffer & luciferin substrate
Random Hexamers	Thermo Scientific	SO142
Real-time GAPDH forward primer			5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC AAAGT-3'
Real-time GAPDH reverse primer			5-'CCCACTCCTCCACCT TTGAC-3'
Real-time IL-23 forward primer			5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC TGAT-3'
Real-time IL-23 reverse primer			5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3'
Real-time IL-6 forward primer			5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3'
Real-time IL-6 reverse primer			5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG GCTG-3'
Reverse Transcriptase	Applied Biosystems	4308228
RNAse inhibitor	Thermo Scientific	EO0381
RT buffer	Promega	A3561
SL1344			Ref # 17
SL1344 ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039			Ref # 18
SL1344 ΔsopE ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039			Ref # 18
SYBR green	Applied Biosystems	4309155	2x mastermix
Tri-reagent	Molecular Research Center	TR 118	guanidine thiocyanate
Trypsin -EDTA	Thermo Fisher	25300054	0.05% Trypsin-EDTA
ultrapure water	Fisher Bioreagents	BP248450
Well plate for PCR	VWR International	89218-294	384-well plate