एनएफ-बी-निर्भर लूसिफ़ेरास सक्रियण और साल्मोनेला संक्रमित ऊतक संस्कृति कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति की मात्रा
Summary
यहां, हम एनएफ-बी को व्यक्त करने वाली सेल लाइनों में सक्रिय बी कोशिकाओं (एनएफ-बी) सक्रियण के परमाणु कारक कापा-लाइट-चेन-एन्हांसमेंट को जल्दी और आसानी से मापने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं:: ल्यूसिफ़ेरे रिपोर्टर का निर्माण, सेल लाइसेट में ल्यूमिनेस के माप के माध्यम से। इसके अतिरिक्त, जीन अभिव्यक्ति साल्मोनेला टाइथिमुरीम से संक्रमित कोशिकाओं से अलग आरटी-क्यूपीसीआर के माध्यम से निर्धारित की जाती है।
Abstract
डिमेरिक ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर एनएफ-बी कई सेलुलर रिस्पांस पाथवे को नियंत्रित करता है, जिसमें विभिन्न साइटोकिन्स और केमोकिन्स की अभिव्यक्ति को प्रेरित करके भड़काऊ रास्ते शामिल हैं। एनएफ-बी बी कोशिकाओं अवरोधक, अल्फा (IοBαα) में कापा प्रकाश पॉलीपेप्टाइड जीन बढ़ाने वाले अवरोधक प्रोटीन परमाणु कारक द्वारा साइटोसोल में संविलियन व्यक्त किया जाता है और इसे तनहा किया जाता है। एनएफ-बी के सक्रियण के लिए IfBα के क्षरण की आवश्यकता होती है, जो तब एनएफ-बी पर परमाणु स्थानीयकरण संकेत को उजागर करता है और नाभिक के लिए अपनी तस्करी को बढ़ावा देता है। एक बार नाभिक में, एनएफ-बी बी अपनी अभिव्यक्ति को बढ़ावा देने के लिए, इंटरल्यूकिन 6 (आईएल-6) और आईएल-23 जैसे एनएफ-ए-बी लक्ष्य जीन के प्रचार क्षेत्र से बांधता है।
एनएफ-बी की सक्रियता प्रतिलेखन या अनुवाद से स्वतंत्र रूप से होती है। इसलिए, एनएफ-बी बी की सक्रियता स्थिति को या तो एनएफ-बी बी को विशेष रूप से नाभिक में, या एनएफ-बी लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित करके मापा जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में, कोशिकाओं को एक NF-inB से छेड़छाड़: ल्यूसिफ़ेरेस रिपोर्टर निर्माण इन विट्रो ऊतक संस्कृति तकनीकों का उपयोग कर एनएफ-बी सक्रियण के लिए परखे हैं। ये कोशिकाएं एनएफ-बी को सक्रिय करने के लिए साल्मोनेला टाइथिमुरियम से संक्रमित हैं, जो नाभिक के लिए यातायात करती है और लूसिफ़ेरेज़ के प्रमोटर क्षेत्र में साइटों को बांधती है, जो इसकी अभिव्यक्ति को प्रेरित करती है। कोशिकाओं को लूसिफ़ेरेज़ परख प्रणाली के साथ विश्लेषण किया जाता है और विश्लेषण किया जाता है। कोशिकाओं द्वारा उत्पादित लूसिफ़ेरेज़ की मात्रा ल्यूमिनेसेंस सिग्नल की तीव्रता से संबंधित है, जिसका पता प्लेट रीडर द्वारा लगाया जाता है। इस प्रक्रिया द्वारा उत्पन्न ल्यूमिनेसेंस सिग्नल एक त्वरित और अत्यधिक संवेदनशील विधि प्रदान करता है जिसके द्वारा कई शर्तों के तहत एनएफ-बी सक्रियण का आकलन किया जाता है। यह प्रोटोकॉल जीन अभिव्यक्ति के संकेत देने वाले सापेक्ष एमआरएनए स्तरों का पता लगाने के लिए मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर (आरटी-क्यूपीसीआर) का भी उपयोग करता है।
Introduction
प्रोटीन का न्यूक्लियर फैक्टर-बी (एनएफ-बी) परिवार महत्वपूर्ण ट्रांसक्रिप्शन एक्टिवेटर है जो विभिन्न जैविक रास्तों में जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करता है । एनएफ-बी की सक्रियता लक्ष्य जीन के प्रतिलेखन को प्रेरित करती है, जिनमें से कई प्रतिरक्षा और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं, कोशिका प्रसार, तनाव प्रतिक्रियाओं और कैंसर प्रगति1,2के लिए महत्वपूर्ण हैं। एनएफ-बी रोगजनक निकासी के लिए प्रारंभिक भड़काऊ परिणामों की मध्यस्थता करने में एक अभिन्न भूमिका निभाता है। एनएफ-बी सक्रियण द्वारा मध्यस्थता की गई कई जैविक प्रक्रियाओं को देखते हुए, इसके सिग्नलिंग में व्यवधान स्वास्थ्य और रोग के लिए गंभीर परिणाम हो सकते हैं। एनएफ-बी सिग्नलिंग में फंक्शन म्यूटेशन की हानि कई प्रतिरक्षा कमी फेनोटाइप में जुड़ी हुई है, जबकि फंक्शन म्यूटेशन का लाभ बी-सेल लिंफोमा और स्तन कैंसर3सहित कई प्रकार के कैंसर से जुड़ा हुआ है। इसके अतिरिक्त, कई रोगजनकों को उग्रता कारकों की अभिव्यक्तिकेमाध्यम से एनएफ-बी की सक्रियता की स्थिति को सीधे रूप से मिलाना दिखाया गया है4,5,6,7।
एनएफ-बी की सक्रियता को कई चर उत्तेजनाओं का परिणाम माना जाता है जिसमें जीवाणु उत्पादों जैसे लिपोपॉलीसैक्चराइड्स (एलपीएस), फ्लैगेलिन और पेप्टिडोग्लिकन जैसे रोगजनक-संबद्ध आणविक पैटर्न (पीम्प्स) के रूप में जाना जाता है। इन पीम्पों का पता पैटर्न रिकग्निशन रिसेप्टर्स (पीआरआरएस) जैसे टोल-लाइक रिसेप्टर्स (टीएलआर) और नोड जैसे रिसेप्टर्स (एनएलआर) द्वारा लगाया जाता है जिससे एनएफ-बी की सक्रियता और एनएफ-बी-निर्भर भड़काऊ जीन8की एक सरणी की बाद की अभिव्यक्ति होती है। पीएआरपी द्वारा पीआरआर एक्टिवेशन के अलावा अन्य बैक्टीरियल प्रॉडक्ट्स जैसे बैक्टीरियल इफेक्टर प्रोटीन एनएफ-बी की एक्टिवेशन को प्रेरित कर सकते हैं । दिलचस्प बात यह है कि बैक्टीरिया प्रभावक प्रोटीन को भी व्यक्त करते हैं जो एनएफ-बी मार्ग को सक्रिय रूप से क्षीण करते हैं और उनकी रोगजनकता को बढ़ाते हैं, जो प्रतिरक्षा9के एक आवश्यक मध्यस्थ के रूप में एनएफ-बी बी के महत्व को रेखांकित करते हैं।
पांच अलग-अलग उपइकाइयां हैं जो एनएफ-बी डिमर्स बनाती हैं; p50, p52, Rela (p65), RelB और cRel । दो मुख्य एनएफ-बी हेटेरोडिमर पी50: रेला और p52: RelB dimers हैं । सक्रिय एनएफ-बी डिमर्स विभिन्न लक्षित जीन के प्रमोटर और बढ़ाने वाले क्षेत्रों में डीएनए साइटों, जिसे बी साइटों के रूप में जाना जाता है, को बांधते हैं। सामान्य होमोस्टैटिक स्थितियों के तहत, एनएफ-बी निष्क्रिय रहने के लिए इफ्ब प्रोटीन के रूप में जाने जाने वाले अवरोधक प्रोटीन के परिवार के साथ बातचीत करता है। उत्तेजना पर, IaB IinB Kinase (IKK) द्वारा फॉस्फोरेटेड है, जो इसे सर्वव्यापकता के लिए लक्षित करने की अनुमति देता है, और बाद में गिरावट। IinB के क्षरण एक परमाणु स्थानीयकरण संकेत का खुलासा करके एनएफ-बी को सक्रिय करता है । एनएफ-बी बी तब नाभिक में स्थानांतरित हो जाता है, जहां यह लक्ष्य जीन के प्रमोटर क्षेत्र में बी साइटों को बांधता है और प्रतिलेखन10को बढ़ावा देता है। इस प्रकार, एनएफ-बी बी की सक्रियता एनएफ-ए-बी लक्ष्य जीन की एमआरएनए अभिव्यक्ति को नियंत्रित करती है, और इस परिवर्तन को आरटी-क्यूपीसीआर11जैसे आरएनए क्वाटिफिकेशन परख के माध्यम से मापा जा सकता है।
कई तरीके मौजूद हैं और आमतौर पर एनएफ-बी एक्टिवेशन के माप नमाप के लिए उपयोग किए जाते हैं, जिसमें इलेक्ट्रोफोरेटिक मोबिलिटी शिफ्ट परख (ईएमएसए), परमाणु स्थानांतरण और जीन रिपोर्टर परख शामिल हैं। ईएमएसए का उपयोग न्यूक्लिक एसिड के साथ प्रोटीन परिसरों का पता लगाने के लिए किया जाता है। उत्तेजित कोशिकाओं को परमाणु प्रोटीन को अलग करने के लिए आंशिक किया जाता है, जिसमें ट्रांसवेल्ड एनएफ-बी बी शामिल है, जिसे फिर एनएफ-बी बाध्यकारी डोमेन वाले रेडियोलेबल न्यूक्लियोटाइड्स के साथ इनक्यूबेटेड किया जाता है। नमूनों को एक जेल पर चलाया जाता है और 32पी-लेबल वाले न्यूक्लिक एसिड की ऑटोरेडियोग्राफी द्वारा इमेजकिया जाता है। यदि एनएफ-बी प्रोटीन अंश में मौजूद है, तो यह न्यूक्लियोटाइड्स को बांध देगा, जो जेल के माध्यम से धीमी गति से माइग्रेट करेगा और असतत बैंड के रूप में मौजूद होगा। सक्रिय एनएफ-बी (जैसे, अउत्तेजित नियंत्रण कोशिकाओं) की कमी कोशिकाओं के परमाणु अंश कोई बैंड का उत्पादन नहीं करेंगे क्योंकि न्यूक्लियोटाइड्स जेल के अंत तक तेजी से माइग्रेट करते हैं। इस विधि की एक बड़ी खामी यह है कि यह बाइनरी अर्थों में काफी हद तक मात्रात्मक है (यानी, ऑन या ऑफ) और एनएफ-बी बाध्यकारी क्षमता में सार्थक मतभेदों को पर्याप्त रूप से कैप्चर नहीं करता है। इसके अतिरिक्त, यह विधि क्रोमेटिन संरचनाओं पर विचार नहीं करती है जो एनएफ-ए-बी लक्ष्य जीन12,13के लिए कार्यात्मक रूप से महत्वपूर्ण हैं।
पिछली विधि के समान, एक “गैर-शिफ्ट” परख है जिसमें बहु-अच्छी प्लेटों को एनएफ-बी बाध्यकारी अनुक्रम वाले न्यूक्लियोटाइड्स के साथ लेपित किया जाता है। प्रोटीन के परमाणु अंशों के साथ कोशिकाओं के उपचार के बाद, एनएफ-बी कुएं से बंधे न्यूक्लियोटाइड्स को बांध देगा। इसके बाद एंटी-एनएफ-बी एंटीबॉडी जोड़े जाते हैं, जो बाउंड एनएफ-बी के साथ बातचीत करेंगे और एनएफ-बी की मात्रा के आनुपातिक रंग-वेीयमेट्रिक सिग्नल का उत्पादन करेंगे, जो एनएफ-बी एक्टिवेशन की डिग्री का संकेत देता है। यह विधि ईएमएसए पर लाभप्रद है जिसमें इसे रेडियोलेबल न्यूक्लिक एसिड की आवश्यकता नहीं होती है और इसकी तुलना में मात्रात्मक है। हालांकि, इस विधि की एक चेतावनी यह है कि यह फिर से एनएफ-बी लक्ष्य जीन14के क्रोमेटिन राज्यों के बीच अंतर नहीं करता है।
एक अन्य विधि जिसके द्वारा एनएफ-बी सक्रियण का पता लगाया जा सकता है वह क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिसिप्रिटेशन (सीआईपी) द्वारा है, जिससे डीएनए और इंटरैटिंग प्रोटीन फॉर्मलडिहाइड के साथ क्रॉस-लिंक होते हैं और विशिष्ट एंटी-एनएफ-बी एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोप्रिसिपिटेटेड होते हैं। विशिष्ट न्यूक्लियोटाइड टुकड़ों को तब पीसीआर प्रवर्धन या प्रत्यक्ष उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण के माध्यम से शुद्ध और पहचाना जाता है। इस विधि से उत्पन्न परिणाम लक्ष्य जीन के साथ एनएफ-बी बाध्यकारी गतिविधि के अर्ध-मात्रात्मक परिणाम प्रदान करते हैं। हालांकि, परिणाम प्रत्येक चरण15पर निर्धारण की स्थिति और शुद्धिकरण प्रक्रियाओं पर अत्यधिक निर्भर हैं।
परमाणु स्थानांतरण परखों में, कोशिकाओं को एनएफ-बी सक्रियण को प्रेरित करने के लिए प्रेरित किया जाता है और फिर तय किया जाता है। एंटी-पी65 एंटीबॉडी को फिक्स्ड कोशिकाओं में जोड़ा जाता है। वैकल्पिक रूप से, p65 सबयूनिट को फ्लोरोसेंट पेप्टाइड जैसे ग्रीन फ्लोरोसेंट ग्रीन (जीएफपी) के साथ टैग किया जा सकता है। किसी भी मामले में, प्रतिरक्षण सेलुलर वितरण निर्धारित करने के लिए p65 के स्थानीयकरण की इमेजिंग की अनुमति देगा। साइटोसोलिक और परमाणु स्थानीयकृत प्रोटीन के अनुपात को मापने के द्वारा, जांचकर्ता एनएफ-बी के सापेक्ष सक्रियण राज्य का निर्धारण कर सकते हैं। इस विधि की एक खामी यह है कि प्रतिरक्षण तुलनात्मक रूप से समय लेने वाला है, महंगे एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है, और अपेक्षाकृत अधिक तकनीकी विशेषज्ञता16की आवश्यकता होती है।
रिपोर्टर जीन आमतौर पर ब्याज के एक जीन के नियामक और अभिव्यक्ति पैटर्न का अध्ययन करने के लिए उपकरण ों का इस्तेमाल किया जाता है । आमतौर पर, रिपोर्टर जीन एक आसानी से पता लगाने योग्य प्रोटीन के लिए एक जीन कोडिंग के लिए जुड़े ब्याज के एक जीन के प्रमोटर अनुक्रम से निर्माण कर रहे हैं । एंजाइमैटिक गतिविधियों, फ्लोरेसेंस, या ल्यूमिनेसेंस गुणों वाले प्रोटीन को आमतौर पर उनकी परखऔर मात्रा निर्धारित करने की क्षमता के लिए चुना जाता है। इस प्रकार, रीड-आउट (उदाहरण के लिए, ल्यूमिनेसेंस, फ्लोरेसेंस) जीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए एक संकेत के रूप में कार्य करता है। इन रिपोर्टर निर्माण ों को विभिन्न सेल प्रकारों में पेश किया जा सकता है, जैसे कि एपिथेलियल कोशिकाएं या मैक्रोफेज।
प्रोटोकॉल में वर्णित एक क्लोन हेला सेल लाइन (HeLa 57A) का उपयोग है जो एक लूसिफ़ेरेस रिपोर्टर से छेड़छाड़ करता है जिसमें इम्यूनोग्लोबुलिन-चेन प्रमोटर क्षेत्र17की तीन प्रतियां होती हैं। लूसिफ़ेरेज़ की अभिव्यक्ति एनएफ-बी की सक्रियता पर निर्भर है, जो कोशिका उत्तेजना के बाद होता है। उत्तेजित कोशिकाओं को आसानी से ल्यूसिफ़ेरेज़ परख किट में प्रदान की जाने वाली सेल लिसिस बफर का उपयोग करके प्रेरित किया जाता है। सेल लाइसेट के एक हिस्से को लूसिफ़ेरेज़ परख बफर के साथ मिलाया जाता है जिसमें लूसिफ़ेरिन होता है। लूसिफ़ेरिन लूसिफ़ेरेज़ का सब्सट्रेट है और लूसिफ़ेरेज़ की उपस्थिति में प्रकाश की पीढ़ी के लिए आवश्यक है। परख बफर को लायसैट के साथ मिलाने के बाद, समाधान ल्यूमिनेसेंस के रूप में जानी जाने वाली प्रक्रिया में प्रकाश उत्सर्जित करेगा। ल्यूमेंस में उत्पादित प्रकाश की मात्रा, लाइसेट में मौजूद लूसिफ़ेरेज़ की मात्रा के आनुपातिक है और एनएफ-बी एक्टिवेशन के उपाय के रूप में कार्य करती है। ल्यूमेन रीडिंग की व्याख्या बेसलाइन एनएफ-बी गतिविधि के लिए खाते में एक अउत्तेजित मानक की तुलना में की जाती है और विश्वसनीय माप के लिए अनुमति देने के लिए संकेत कई मिनट तक स्थिर होता है। इसके अलावा, वाघेला 57A सेल लाइन एक NF-nF-nF-स्वतंत्र-galactosidase रिपोर्टर से छेड़छाड़ से ट्रांसफुटी है । इस रिपोर्टर को संविलियन रूप से व्यक्त किया जाता है, और सेल व्यवहार्यता या सेल संख्या17में भिन्नता के लिए नियंत्रण करने के लिए मापा जा सकता है। लूसिफ़ेरेज़ मूल्यों को तब -गैलेक्टोसिदास मूल्यों में समायोजित किया जा सकता है और अउत्तेजित नियंत्रण कोशिकाओं पर गुना वृद्धि के रूप में सूचित किया जा सकता है।
चूंकि एनएफ-बी बी एनएफ-बी-निर्भर लक्ष्य जीन की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति के लिए जिम्मेदार एक प्रतिलेखन कारक है, इसलिए एनएफ-निर्भर जीन अभिव्यक्ति के लिए नियंत्रण के लिए एक अनुवर्ती प्रयोग मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन है ( आरटी-क्यूपीसीआर) । आरटी-क्यूपीसीआर एक अत्यधिक संवेदनशील तरीका है जिसके द्वारा जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन परिमाण के कई आदेशों पर मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। फेनॉल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण के माध्यम से आरएनए के लिए उत्तेजित और नियंत्रण कोशिकाओं को काटा जाता है। चरण जुदाई के बाद, आरएनए जलीय परत के प्रमुख घटक के रूप में निकाला जाता है। आरएनए तो उपजी है और एक शुद्ध गोली का उत्पादन करने के लिए धोया जाता है । इस गोली का पुनर्गठन किया जाता है और DNase उपचार के माध्यम से संदूषक डीएनए से आगे साफ किया जाता है। शुद्ध आरएनए तो पूरक डीएनए (सीडीएनए) बनाने के लिए लिखित रिवर्स है। इस सीडीएनए का विश्लेषण मात्रात्मक पीसीआर तकनीकों के माध्यम से किया जा सकता है, जहां जीन अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए एक विशिष्ट एमआरएनए अनुक्रम की बहुतायत निर्धारित की जाती है। यह तकनीक ट्रांसलेशनल कंट्रोल, पोस्ट ट्रांसलेशनल संशोधन, प्रोटीन बहुतायत या प्रोटीन गतिविधि को स्पष्ट नहीं करती है। हालांकि, कई जीन, विशेष रूप से समर्थक भड़काऊ प्रक्रियाओं में शामिल लोगों को एनएफ-बी के माध्यम से विनियमित किया जाता है और उनकी एमआरएनए बहुतायत उनकी अभिव्यक्ति का संकेत है।
यहां प्रस्तावित विधि एक तेज और सरल तरीके का उपयोग करती है जिसके द्वारा एनएफ-बी सक्रियण का पता सेलुलर lysate के ल्यूमिनेसेंस परख के माध्यम से लगाया जा सकता है। एनएफ-बी लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति के आरटी-क्यूपीसीआर का उपयोग विशेष जीन की अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित करने के साथ-साथ एनएफ-बी एक्टिवेशन की कार्यात्मक गतिविधि को मान्य करने के लिए किया जा सकता है। इस तरह की प्रणाली के प्रमुख फायदे इसकी सादगी और गति हैं, जो एनएफ-बी सक्रियण को मिलाने वाली शर्तों की एक श्रृंखला की उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है। यह प्रोटोकॉल एनएफ-बी को व्यक्त करने वाली अन्य सेल लाइनों के लिए उपयुक्त है:: लूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर, और18को स्थिर रूप से ट्रांससंक्रमित RAW264.7 कोशिकाओं में प्रदर्शित किया गया है। नमूनों को संभालने के लिए आवश्यक समय की मात्रा, सेल लिसिस से शुरू करने के लिए एक ल्यूमिनेसेंस संकेत पैदा करने के लिए, कम से कम है और लगभग एक घंटे की अवधि लेता है। एनएफ-बी के मापके के लिए केवल बुनियादी प्रयोगशाला उपकरणों जैसे अपारदर्शी प्लेटों, ल्यूमिनेसेंस को मापने में सक्षम प्लेट रीडर, और स्प्रेडशीट प्रोग्राम जैसे सरल डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर की आवश्यकता होती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्णित प्रोटोकॉल का प्रमुख योगदान यह है कि यह कोशिकाओं में एनएफ-बी सक्रियण का पता लगाने के लिए एक तेज और आसान तरीका प्रदान करता है, जो एनएफ-बी एक्टिवेशन को प्रभावित करने वाली कई उत्तेजक स्थितियों या दवा…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
कीस्ट्रा-गौंडर लैब में अनुसंधान पुरस्कार संख्या R21AI122092 के तहत NIH के NIAID से अनुदान द्वारा समर्थित है और पुरस्कार संख्या 1-18-JDF-035 के तहत अमेरिकन डायबिटीज एसोसिएशन से ।
Materials
| Adhesive film | VWR International | 60941-070 | |
| chloroform | Fisher Bioreagents | C298-500 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11665092 | |
| DNAse treatment kit | Qiagen | 79254 | |
| dNTPs | Promega | U1511 | |
| ethanol | Fisher Bioreagents | BP2818100 | molecular grade |
| FBS | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| HeLa 57A cells | Ref # 15 | ||
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| isopropanol | Fisher Bioreagents | BP26181 | |
| Kanamycin | Fisher Bioreagents | BP906-5 | |
| LB agar | Fisher Bioreagents | BP1425-500 | |
| Lysogeny broth | Fisher Bioreagents | BP1426-500 | |
| MgCl2 | Fisher Chemical | ||
| NanoDrop ND-1000 | Thermo Scientific | spectrophotometer | |
| promega luciferase assay system | Promega | E1501 | Cell lysis buffer & luciferin substrate |
| Random Hexamers | Thermo Scientific | SO142 | |
| Real-time GAPDH forward primer | 5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC AAAGT-3' |
||
| Real-time GAPDH reverse primer | 5-'CCCACTCCTCCACCT TTGAC-3' |
||
| Real-time IL-23 forward primer | 5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC TGAT-3' |
||
| Real-time IL-23 reverse primer | 5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3' | ||
| Real-time IL-6 forward primer | 5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3' | ||
| Real-time IL-6 reverse primer | 5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG GCTG-3' |
||
| Reverse Transcriptase | Applied Biosystems | 4308228 | |
| RNAse inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | |
| RT buffer | Promega | A3561 | |
| SL1344 | Ref # 17 | ||
| SL1344 ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 | Ref # 18 | ||
| SL1344 ΔsopE ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 | Ref # 18 | ||
| SYBR green | Applied Biosystems | 4309155 | 2x mastermix |
| Tri-reagent | Molecular Research Center | TR 118 | guanidine thiocyanate |
| Trypsin -EDTA | Thermo Fisher | 25300054 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| ultrapure water | Fisher Bioreagents | BP248450 | |
| Well plate for PCR | VWR International | 89218-294 | 384-well plate |
Referências
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