NF-κB-dependente Luciferase Ativação e Quantificação da Expressão Gênica em Salmonella Células Cultura dos Tecidos Infectados

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para medir rapidamente e facilmente o fator nuclear kappa-light-chain-enhancer de células B ativadas (NF-κB) ativação em linhas celulares expressando NF-κB::luciferase repórter constrói, através de medições de luminescência no lysate celular. Além disso, a expressão gênica é determinada via RT-qPCR isolada de células infectadas com Salmonella Typhimurium.

Abstract

O fator dimeric da transcrição NF-κB regula muitos caminhos celulares da resposta, incluindo caminhos inflamatórios induzindo a expressão de várias citocinas e chemokines. NF-κB é constitutivamente expresso e é seqüestrado no citosol pelo fator nuclear de proteína inibitiva do potenciador de genes de polipeptídeos leves kappa no inibidor de células B, alfa (IκBα). A ativação do NF-κB requer a degradação do IκBα, que então expõe um sinal de localização nuclear no NF-κB e promove seu tráfico para o núcleo. Uma vez no núcleo, nf-κb liga-se à região promotor de NF-κB alvo genes como interleucina 6 (IL-6) e IL-23, para promover a sua expressão.

A ativação do NF-κB ocorre independentemente da transcrição ou tradução. Portanto, o estado de ativação do NF-κB deve ser medido por quantificar nf-κB especificamente no núcleo, ou por quantificar a expressão de NF-κB alvo genes. Neste protocolo, as células evigoradas com um NF-κB::luciferase repórter construir são auplado para nf-κb ativação usando in vitro tecido cultura técnicas. Essas células estão infectadas com Salmonella Typhimurium para ativar nf-κb, que trafica para o núcleo e se liga a κB sites na região promotor a luciferase, induzindo a sua expressão. As células são lysed e analisados com o sistema de ensaio luciferase. A quantidade de luciferase produzida pelas células correlaciona-se com a intensidade do sinal de luminescência, que é detectado por um leitor de placas. O sinal de luminescência gerado por este procedimento fornece um método rápido e altamente sensível pelo qual avaliar a ativação nf-κB uma série de condições. Este protocolo também utiliza a transcrição reversa quantitativa PCR (RT-qPCR) para detectar níveis relativos de mRNA que são indicativos de expressão gênica.

Introduction

A família de proteínas fator-κB nuclear (NF-κB) são importantes ativadores de transcrição que regulam a expressão gênica em várias vias biológicas. A ativação do NF-κB induz a transcrição de genes-alvo, muitos dos quais são importantes para respostas imunes e inflamatórias, proliferação celular, respostas ao estresse e progressão do câncer^1,2. NF-κB desempenha um papel integral na mediação dos primeiros resultados inflamatórios para a desminagem de patógenos. Dado os muitos processos biológicos mediados pela ativação nf-κB, interrupções em sua sinalização podem ter sérias conseqüências para a saúde e doença. A perda de mutações de função na sinalização NF-κB está associada em vários fenótipos de deficiência imunológica, enquanto o ganho de mutações de função está associado a vários tipos de cânceres, incluindo linfomas de células B e câncer de mama³. Além disso, muitos patógenos têm demonstrado modular diretamente o estado de ativação do NF-κB através da expressão dos fatores de virulência^4,5,6,7.

A ativação do NF-κB é conhecida por ser uma conseqüência de muitos estímulos variáveis, incluindo produtos bacterianos, como lipopolissacarídeos (LPS), flagenina e peptidoglicans conhecidos como padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs). Esses PAMPs são detectados por receptores de reconhecimento de padrões (PRRs), como os receptores semelhantes a pedágios (TLRs) e receptores semelhantes ao Nod (NLRs), levando à ativação do NF-κB e à expressão subsequente de uma matriz de genes inflamatórios dependentes de NF-κB⁸. Além da ativação da RPR por PAMPs, outros produtos bacterianos, como proteínas efívoras, podem induzir a ativação do NF-κB. Curiosamente, as bactérias também expressam proteínas efetivas que atenuam ativamente a via NF-κB e aumentam sua patogenicidade, ressaltando a importância da NF-κB como mediador essencial da imunidade⁹.

Existem cinco subunidades diferentes que formam os dimers NF-κB; p50, p52, RelA (p65), RelB e cRel. Os dois principais heterodimers NF-κB são o p50:RelA e o p52:RelB dimers. Os dimers nf-κb ativados ligam-se a locais de DNA, conhecidos como locais de κB, nas regiões promotoras e potenciadoras de vários genes-alvo. Em condições homeostáticas normais, nf-κb interage com uma família de proteínas inibidoras conhecidas como proteínas IκB para permanecer inativo. Após a estimulação, iκB é fosforilado por IκB Kinase (IKK), que permite que ele seja alvo de ubiquitinação e, posteriormente, degradação. Degradação do IκB ativa NF-κB, revelando um sinal de localização nuclear. NF-κB, em seguida, translocaliza para o núcleo, onde liga locais κB na região promotor de genes-alvo e promover a transcrição¹⁰. Assim, a ativação do NF-κB regula a expressão de mRNA de genes-alvo NF-κB, e essa mudança pode ser medida através de ensaios de quantificação de RNA, como RT-qPCR¹¹.

Vários métodos existem e são comumente usados para a medição da ativação nf-κb, incluindo ensaios de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA), translocação nuclear e ensaios de repórters genéticos. A EMSA é usada para detectar complexos proteicos com ácidos nucleicos. As células estimuladas são fracionadas para isolar proteínas nucleares, incluindo o NF-κB translocado, que é então incubado com nucleotídeos radiografados contendo o domínio de ligação NF-κB. As amostras são executadas em um gel e imagemdas por autoradiografia de ³²ácidos nucleicos p-etiquetados. Se nf-κb está presente na fração de proteína, ele vai ligar os nucleotídeos, que migrará mais lento através do gel e presente como bandas discretas. Frações nucleares de células sem NF-κB ativado (por exemplo, células de controle não estimuladas) não produzirão bandas à medida que os nucleotídeos migrarem mais rápido para o final do gel. Uma grande desvantagem deste método é que ele é em grande parte quantitativo no sentido binário (ou seja, dentro ou fora) e não captura adequadamente diferenças significativas na capacidade de ligação NF-κB. Além disso, este método não considera estruturas de cromatina que são funcionalmente importantes para os genes-alvo NF-κB^12,13.

Semelhante ao método anterior, há um ensaio “não-turno”, no qual placas multi-poço são revestidas com nucleotídeos contendo a seqüência de ligação NF-κB. Após o tratamento de células com frações nucleares de proteína, NF-κB vai ligar-se aos nucleotídeos ligados ao poço. Os anticorpos anti-NF-κB são então adicionados, que interagirão com o NF-κB vinculado e produzirão um sinal colorimétrico proporcional à quantidade de NF-κB, indicando o grau de ativação nf-κB. Este método é vantajoso sobre o EMSA na medida em que não requer ácidos nucleicos radiorotulados e é quantitativo, em comparação. No entanto, uma ressalva deste método é que ele novamente não diferencia entre os estados de cromatina de NF-κB alvo genes¹⁴.

Outro método pelo qual a ativação nf-κb pode ser detectada é por imunoprecipitação de cromatina (ChIP), pelo qual o DNA e as proteínas interagindo estão interligados com formaldeído e imunoprecipitado com anticorpos específicos anti-NF-κB. Os fragmentos específicos do nucleotídeo são então purificados e identificados através da amplificação do PCR ou do sequenciamento de alta transferência direta. Os resultados gerados a partir deste método fornecem resultados semiquantitativos da atividade de ligação NF-κB com genes-alvo. No entanto, os resultados são altamente dependentes das condições de fixação e dos processos de purificação em cada etapa^15.

Em ensaios de translocação nuclear, as células são estimuladas a induzir a ativação nf-κb e, em seguida, corrigido. Os anticorpos anti-p65 são adicionados às células fixas. Alternativamente, o subunidade p65 em si pode ser marcado com um peptídeo fluorescente, como verde fluorescente verde (GFP). Em ambos os casos, a imunofluorescência permitirá que a imagem latente da localização do p65 determine a distribuição celular. Medindo a proporção de proteína localizada citossólica e nuclear, os investigadores podem determinar o estado relativo de ativação do NF-κB. Uma desvantagem deste método é que a imunofluorescência é comparativamente demorada, requer anticorpos caros e precisa de experiência técnica relativamente maior^16.

Genes de repórter são ferramentas comumente usadas para estudar os padrões regulatórios e de expressão de um gene de interesse. Tipicamente, os genes do repórter são construídos da seqüência do promotor de um gene do interesse fundido a uma codificação do gene para uma proteína facilmente detectável. Proteínas com atividades enzimáticas, fluorescência ou propriedades de luminescência são comumente escolhidas por sua capacidade de serem assumidas e quantificadas. Assim, a leitura (por exemplo, luminescência, fluorescência) serve como um sinal para a detecção da expressão gênica. Estas construções do repórter podem então ser introduzidas em tipos diferentes da pilha, tais como pilhas epiteliais ou macrófagos.

Descrito no protocolo é o uso de uma linha de células HeLa clonada (HeLa 57A) que é evigorada mente transfeccionada com um repórter lúciferase contendo três cópias do consenso κB da imunoglobulina tradi-chain promotor região¹⁷. A expressão de luciferase depende da ativação do NF-κB, que ocorre após a estimulação celular. As células estimuladas são facilmente lysed usando tampão de lyse celular fornecido no kit de ensaio luciferase. Uma parte do lysate celular é então misturada com tampão de ensaio luciferase que contém luciferino. Luciferin é o substrato de lúciferase e é necessário para a geração de luz na presença de lúciferase. Depois de combinar o amortecedor de ensaio com o liceu, a solução emitirá luz em um processo conhecido como luminescência. A quantidade de luz produzida, dada em lumens, é proporcional à quantidade de lúciferase presente no lysate e serve como medida de ativação nf-κB. As leituras do lúmen são interpretadas em comparação com um padrão não estimulado para dar conta da atividade de linha de base NF-κB e o sinal em si é estável por vários minutos para permitir uma medição confiável. Além disso, a linha celular HeLa 57A está evigorada com um repórter independente de NF-κB β-galactosidase. O repórter β-galactosidase é expresso constitutivamente, e a atividade β-galactosidase pode ser medida para controlar a viabilidade celular ou variação nos números celulares^17. Os valores de luciferase podem então ser ajustados aos valores β-galactosidase e relatados como aumento da dobra sobre as células de controle não estimuladas.

Como o NF-κB é um fator de transcrição responsável pelo aumento da expressão de genes-alvo dependentes de NF-κB, um experimento de acompanhamento para controlar o aumento da expressão gênica dependente de NF-κB é a reação quantitativa em cadeia de transcrição reversa ( RT-qPCR). RT-qPCR é um método altamente sensível pelo qual as mudanças na expressão gênica podem ser quantificadas ao longo de várias ordens de magnitude. Células estimuladas e de controle são colhidas para RNA através da extração fenol-clorofórmio. Após a separação de fase, o RNA é extraído como o principal componente da camada aquosa. RNA é então precipitado e lavado para produzir uma pelota pura. Esta pelota é então reconstituída e ainda mais limpa de DNA contaminante através do tratamento do DNAse. O RNA puro é então transcrito reverso para criar DNA complementar (CDNA). Este CDNA pode então ser analisado através de técnicas quantitativas de PCR, onde a abundância de uma sequência específica de mRNA é quantificada para determinar a expressão gênica. Esta técnica não elucida o controle translacional, a modificação pós-translacional, a abundância de proteínas ou a atividade proteica. No entanto, muitos genes, particularmente aqueles envolvidos em processos pró-inflamatórios, são regulados via NF-κB e sua abundância de mRNA é indicativa de sua expressão.

O método proposto aqui utiliza uma maneira rápida e simples pela qual a ativação NF-κB pode ser detectada através de ensaios de luminescência de lisoza celular. RT-qPCR de NF-κB expressão gênica alvo pode ser usado para quantificar a expressão de genes particulares, bem como validar a atividade funcional da ativação NF-κB. As principais vantagens de tal sistema são sua simplicidade e velocidade, o que permite a triagem de alta produtividade de uma série de condições que modulam a ativação nf-κB. Este protocolo é adequado para outras linhas celulares expressando um NF-κB::luciferase repórter, e tem sido demonstrado em evigorados RAW264.7 células¹⁸. A quantidade de tempo necessária para lidar com amostras, a partir de lyse celular para gerar um sinal de luminescência, é mínima e leva o espaço de cerca de uma hora. A medição do NF-κB requer apenas equipamentos básicos de laboratório, como placas opacas, um leitor de placas capaz de medir a luminescência e um software simples de análise de dados, como um programa de planilha.

Protocol

1. Passaging e semeadura da pilha Mantenha as células HeLa 57A em um frasco de 75 cm2 contendo 10 mL da mídia eagle modificada de Dulbecco (DMEM) complementada com 5% de calor inativado soro bovino fetal (FBS) em 37 °C em uma incubadora de 5% CO2. Aspirate mídia cultura celular e lavar com 1 mL de 0,05% solução trypsin-EDTA. Aspirate trypsin e substituir por um adicional de 1 mL. Coloque o frasco em uma incubadora de 37 °C por 4-5 min para permitir que as células se separ…

Representative Results

O ensaio descrito aqui centra-se na ativação do fator de transcrição NF-κB usando um repórter luciferase nf-κB-dependente que é evigorado em uma linha de células HeLa. Ativado NF-κB transloca para o núcleo onde liga κB sites de ligação de genes-alvo, incluindo as citocinas pró-inflamatórias IL6 e IL23. Uma visão geral da ativação nf-κb é retratada na Figura 1. A bactéria gram-negativa Salmonella enterica serova…

Discussion

A principal contribuição do protocolo descrito é que ele fornece um método rápido e fácil para detectar a ativação NF-κB em células, o que permite uma análise de alta taxa de taxa de taxa de múltiplas condições de estímulo ou medicamentos que afetam a ativação nf-κb. Aqui, descrevemos um protocolo para a ativação nf-κb em células HeLa infectadas por Salmonella. Estas pilhas podem ser usadas para a infecção com outros micróbios patogénicos também para estudar o impacto da infecção bac…

Materials

Adhesive film	VWR International	60941-070
chloroform	Fisher Bioreagents	C298-500
DMEM	Thermo Fisher	11665092
DNAse treatment kit	Qiagen	79254
dNTPs	Promega	U1511
ethanol	Fisher Bioreagents	BP2818100	molecular grade
FBS	Sigma-Aldrich	F0926
HeLa 57A cells			Ref # 15
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4368814
isopropanol	Fisher Bioreagents	BP26181
Kanamycin	Fisher Bioreagents	BP906-5
LB agar	Fisher Bioreagents	BP1425-500
Lysogeny broth	Fisher Bioreagents	BP1426-500
MgCl2	Fisher Chemical
NanoDrop ND-1000	Thermo Scientific		spectrophotometer
promega luciferase assay system	Promega	E1501	Cell lysis buffer & luciferin substrate
Random Hexamers	Thermo Scientific	SO142
Real-time GAPDH forward primer			5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC AAAGT-3'
Real-time GAPDH reverse primer			5-'CCCACTCCTCCACCT TTGAC-3'
Real-time IL-23 forward primer			5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC TGAT-3'
Real-time IL-23 reverse primer			5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3'
Real-time IL-6 forward primer			5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3'
Real-time IL-6 reverse primer			5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG GCTG-3'
Reverse Transcriptase	Applied Biosystems	4308228
RNAse inhibitor	Thermo Scientific	EO0381
RT buffer	Promega	A3561
SL1344			Ref # 17
SL1344 ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039			Ref # 18
SL1344 ΔsopE ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039			Ref # 18
SYBR green	Applied Biosystems	4309155	2x mastermix
Tri-reagent	Molecular Research Center	TR 118	guanidine thiocyanate
Trypsin -EDTA	Thermo Fisher	25300054	0.05% Trypsin-EDTA
ultrapure water	Fisher Bioreagents	BP248450
Well plate for PCR	VWR International	89218-294	384-well plate