Activación y cuantificación de la expresión génica dependiente de NF--B en células de cultivo de tejido infectado por Salmonella
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para medir rápida y fácilmente el factor nuclear kappa-light-chain-enhancer de la activación de células B activadas (NF–B) en líneas celulares que expresan las construcciones de reporteronf-B::luciferase, a través de mediciones de luminiscencia en el lisado celular. Además, la expresión génica se determina a través de RT-qPCR aislado de células infectadas con Salmonella Typhimurium.
Abstract
El factor de transcripción dimerica NF–B regula muchas vías de respuesta celular, incluyendo vías inflamatorias induciendo la expresión de varias citoquinas y quimioquinas. NF–B se expresa constitutivamente y es secuestrado en el citosol por el factor nuclear de proteína inhibitoria del potenciador del gen de polipéptido ligero kappa en el inhibidor de las células B, alfa (I-B). La activación de NF–B requiere la degradación de I-B, que luego expone una señal de localización nuclear en NF-B y promueve su tráfico al núcleo. Una vez en el núcleo, NF-B se une a la región promotora de los genes diana NF-B, como la interleucina 6 (IL-6) y la IL-23, para promover su expresión.
La activación de NF-B se produce independientemente de la transcripción o la traducción. Por lo tanto, el estado de activación de NF-B debe medirse mediante la cuantificación de NF-B específicamente en el núcleo, o mediante la cuantificación de la expresión de los genes diana NF-B. En este protocolo, las células transfectó de forma estable con una construcción de reportero NF-B::luciferase para la activación de NF-B utilizando técnicas de cultivo de tejido in vitro. Estas células están infectadas con Salmonella Typhimurium para activar NF-B, que se trafica con el núcleo y se une a los sitios B en la región promotora de la luciferasa, induciendo su expresión. Las células se lysed y analizan con el sistema de ensayo luciferase. La cantidad de luciferasa producida por las células se correlaciona con la intensidad de la señal de luminiscencia, que es detectada por un lector de placas. La señal de luminiscencia generada por este procedimiento proporciona un método rápido y altamente sensible para evaluar la activación NF-B bajo una serie de condiciones. Este protocolo también utiliza PCR de transcripción inversa cuantitativa (RT-qPCR) para detectar niveles relativos de ARNm que son indicativos de expresión génica.
Introduction
La familia de proteínas del factor nuclear B (NF-B) son importantes activadores de transcripción que regulan la expresión génica en varias vías biológicas. La activación de NF-B induce la transcripción de genes diana, muchos de los cuales son importantes para las respuestas inmunitarias e inflamatorias, la proliferación celular, las respuestas al estrés y la progresión del cáncer1,2. Nf–B desempeña un papel integral en la mediación de los primeros resultados inflamatorios para el aclaramiento de patógenos. Dados los muchos procesos biológicos mediados por la activación nf-B, las interrupciones en su señalización pueden tener graves consecuencias para la salud y la enfermedad. La pérdida de mutaciones de la función en la señalización NF-B se asocia en varios fenotipos de deficiencia inmune, mientras que la ganancia de mutaciones de función se asocia con varios tipos de cáncer, incluyendo linfomas de células B y cánceres de mama3. Además, se ha demostrado que muchos patógenos modulan directamente el estado de activación de NF-B a través de la expresión de factores de virulencia4,5,6,7.
Se sabe que la activación de NF–B es una consecuencia de muchos estímulos variables, incluidos productos bacterianos como lipopolisacáridos (LPS), flagelina y peptidoglicanos conocidos como patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP). Estos MTP son detectados por receptores de reconocimiento de patrones (PRR) tales como los receptores similares a los peajes (TIR) y los receptores similares a Nod (NRM) que conducen a la activación de NF-B y la posterior expresión de una matriz de genes inflamatorios dependientes de NF-B8. Además de la activación de PRR por Los PamP, otros productos bacterianos, como las proteínas efectoras bacterianas, pueden inducir la activación de NF-B. Curiosamente, las bacterias también expresan proteínas efectoras que atenúan activamente la vía NF-B y mejoran su patogenicidad, subrayando la importancia de NF-B como mediador esencial de la inmunidad9.
Hay cinco subunidades diferentes que forman los dimers NF-B; p50, p52, RelA (p65), RelB y cRel. Los dos heterodímeros principales NF-B son los dimers p50:RelA y p52:RelB. Los dimers NF-B activados se unen a sitios de ADN, conocidos como sitios B, en las regiones promotoras y potenciadoras de varios genes diana. En condiciones homeostáticas normales, NF-B interactúa con una familia de proteínas inhibidoras conocidas como proteínas I-B para permanecer inactivas. Tras la estimulación, el I-B es fosforilado por la Kinasa (IKK, por sus cuales) es blanco de la ubiquitinación y, posteriormente, de la degradación. La degradación de I-B activa NF-B al revelar una señal de localización nuclear. A continuación, NF–B se traslada al núcleo, donde se une a los sitios B en la región promotora de los genes diana y promueve la transcripción10. Por lo tanto, la activación de NF–B regula la expresión de ARNm de los genes diana NF-B, y este cambio se puede medir a través de ensayos de cuantificación de ARN como RT-qPCR11.
Existen varios métodos que se utilizan comúnmente para la medición de la activación NF-B, incluyendo ensayos de cambio de movilidad electroforética (EMSA), translocación nuclear y ensayos de reporteros genéticos. EMSA se utiliza para detectar complejos proteicos con ácidos nucleicos. Las células estimuladas se fraccionan para aislar las proteínas nucleares, incluyendo la NF-B transubicada, que luego se incuba con nucleótidos radiomarcados que contienen el dominio de unión NF-B. Las muestras se ejecutan en un gel e imágenes por autoradiografía de ácido nucleico etiquetado 32P. Si la NF-B está presente en la fracción proteica, unirá los nucleótidos, que migrarán más lentamente a través del gel y se presentarán como bandas discretas. Las fracciones nucleares que carecen de NF-B activado (por ejemplo, células de control no estimuladas) no producirán bandas a medida que los nucleótidos migran más rápido hasta el final del gel. Un inconveniente importante de este método es que es en gran medida cuantitativo en el sentido binario (es decir, encendido o desactivado) y no captura adecuadamente diferencias significativas en la capacidad de enlace NF-B. Además, este método no tiene en cuenta las estructuras de cromatina que son funcionalmente importantes para los genes diana NF-B12,13.
Al igual que el método anterior, hay un ensayo “sin desplazamiento” en el que las placas multipozo están recubiertas con nucleótidos que contienen la secuencia de unión NF-B. Después del tratamiento de las células con fracciones nucleares de proteína, NF-B se unirá a los nucleótidos unidos al pozo. A continuación, se añaden anticuerpos anti-NF-B, que interactuarán con el NF-B enlazado y producirán una señal colorimétrica proporcional a la cantidad de NF-B, indicando el grado de activación NF-B. Este método es ventajoso sobre la EMSA en el que no requiere ácidos nucleicos radiomarcados y es cuantitativo, en comparación. Sin embargo, una advertencia de este método es que de nuevo no diferencia entre los estados de cromatina de los genes diana NF-B14.
Otro método por el cual se puede detectar la activación NF-B es mediante la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), mediante el cual el ADN y las proteínas que interactúan se reticulan con el formaldehído y se inmunoprecipitan con anticuerpos específicos anti-NF-B. Los fragmentos de nucleótidos específicos se purifican e identifican a través de la amplificación de PCR o la secuenciación directa de alto rendimiento. Los resultados generados a partir de este método proporcionan resultados semicuantitativos de la actividad de unión NF-B con genes diana. Sin embargo, los resultados dependen en gran medida de las condiciones de fijación y los procesos de purificación en cada paso15.
En los ensayos de translocación nuclear, las células se estimulan para inducir la activación NF-B y luego se fijan. Los anticuerpos anti-p65 se añaden a las células fijas. Alternativamente, la subunidad p65 en sí se puede etiquetar con un péptido fluorescente como verde fluorescente verde (GFP). En cualquier caso, la inmunofluorescencia permitirá la localización de la localización de p65 para determinar la distribución celular. Mediante la medición de la proporción de proteína termosólica y nuclear localizada, los investigadores pueden determinar el estado de activación relativa de NF-B. Un inconveniente de este método es que la inmunofluorescencia es comparativamente lenta, requiere anticuerpos caros, y necesita una experiencia técnica relativamente mayor16.
Los genes reporteros son herramientas comúnmente utilizadas para estudiar los patrones regulatorios y de expresión de un gen de interés. Por lo general, los genes reporteros se construyen a partir de la secuencia promotora de un gen de interés fusionado con un gen que codifica para obtener una proteína fácilmente detectable. Las proteínas con actividades enzimáticas, fluorescencia o propiedades luminiscencias se eligen comúnmente por su capacidad de ensayo y cuantificación. Por lo tanto, la lectura (por ejemplo, luminiscencia, fluorescencia) sirve como una señal para la detección de la expresión génica. Estas construcciones de reportero se pueden introducir en diferentes tipos de células, como células epiteliales o macrófagos.
En el protocolo se describe el uso de una línea celular Clonada HeLa (HeLa 57A) que está establemente transfectó con un reportero de luciferasa que contiene tres copias del consenso b de la región promotora de la cadena de inmunoglobulina17. La expresión de la luciferasa depende de la activación de NF-B, que se produce después de la estimulación celular. Las células estimuladas se lysed fácilmente utilizando tampón de lisis celular proporcionado en el kit de ensayo luciferasa. Una porción del lisado celular se mezcla con el tampones de ensayo de luciferasa que contiene luciferina. Luciferin a is the substrate of luciferase and is required for the generation of light in the presence of luciferase. Después de combinar el tampón de ensayo con el isla, la solución emitirá luz en un proceso conocido como luminiscencia. La cantidad de luz producida, dada en lúmenes, es proporcional a la cantidad de luciferasa presente en el lisado y sirve como una medida de activación NF-B. Las lecturas de lumen se interpretan en comparación con un estándar no estimulado para tener en cuenta la actividad de referencia NF-B y la señal en sí es estable durante varios minutos para permitir una medición confiable. Además, la línea celular HeLa 57A está establemente transtrinfectada con un reportero de nf–B-independiente de la galactosidasa. El reportero de galactosidasa se expresa constitutivamente, y la actividad de la galactosidasa se puede medir para controlar la viabilidad celular o la variación en los números de celda17. Los valores de luciferasa se pueden ajustar a los valores de la galactosidasa y notificarse como aumento del pliegue sobre las células de control no estimuladas.
Dado que NF–B es un factor de transcripción responsable del aumento de la expresión de los genes diana dependientes de NF-B, un experimento de seguimiento para controlar el aumento de la expresión génica dependiente de NF-B es la reacción en cadena cuantitativa de la transcripción inversa de la polimerasa ( RT-qPCR). RT-qPCR es un método altamente sensible por el cual los cambios en la expresión génica se pueden cuantificar en varios órdenes de magnitud. Las células estimuladas y de control se cosechan para el ARN a través de la extracción de fenol-cloroformo. Después de la separación de fase, el ARN se extrae como el componente principal de la capa acuosa. El ARN se precipita y se lava para producir un pellet puro. Este pellet se reconstituye y limpia aún más el ADN contaminante a través del tratamiento con DNase. El ARN puro se transcribe a la inversa para crear ADN complementario (ADNc). Este ADNc puede ser analizado a través de técnicas cuantitativas de PCR, donde la abundancia de una secuencia de ARNm específica se cuantifica para determinar la expresión génica. Esta técnica no dilucida el control traslacional, la modificación post traslacional, la abundancia de proteínas o la actividad proteica. Sin embargo, muchos genes, particularmente los involucrados en procesos pro-inflamatorios, están regulados a través de NF-B y su abundancia de ARNm es indicativa de su expresión.
El método propuesto aquí utiliza una forma rápida y sencilla por la cual la activación NF-B se puede detectar a través de ensayos de luminiscencia de lisato celular. RT-qPCR de la expresión génica diana NF-B se puede utilizar para cuantificar la expresión de genes particulares, así como para validar la actividad funcional de la activación NF-B. Las principales ventajas de un sistema de este tipo son su simplicidad y velocidad, lo que permite el cribado de alto rendimiento de una gama de condiciones que modulan la activación NF-B. Este protocolo es adecuado para otras líneas celulares que expresan un reportero NF-B::luciferase, y se ha demostrado en células RAW264.7 transotrófilos estables18. La cantidad de tiempo necesario para manejar las muestras, desde la lisis celular hasta la generación de una señal de luminiscencia, es mínima y ocupa aproximadamente una hora. La medición de NF-B requiere sólo equipos básicos de laboratorio como placas opacas, un lector de placas capaz de medir la luminiscencia y un software de análisis de datos simple, como un programa de hoja de cálculo.
Protocol
Representative Results
Discussion
La contribución principal del protocolo descrito es que proporciona un método rápido y fácil para detectar la activación NF-B en las células, lo que permite un análisis de alto rendimiento de múltiples condiciones estimulantes o fármacos que afectan a la activación NF-B. Aquí, describimos un protocolo para la activación NF-B en las células HeLa infectadas por Salmonella. Estas células se pueden utilizar para la infección con otros patógenos, así como para estudiar el impacto de la infección bac…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La investigación en el laboratorio Keestra-Gounder está respaldada por subvenciones del NIAID del NIH bajo el número de premio R21AI122092 y de la Asociación Americana de la Diabetes bajo el Premio Número 1-18-JDF-035.
Materials
| Adhesive film | VWR International | 60941-070 | |
| chloroform | Fisher Bioreagents | C298-500 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11665092 | |
| DNAse treatment kit | Qiagen | 79254 | |
| dNTPs | Promega | U1511 | |
| ethanol | Fisher Bioreagents | BP2818100 | molecular grade |
| FBS | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| HeLa 57A cells | Ref # 15 | ||
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| isopropanol | Fisher Bioreagents | BP26181 | |
| Kanamycin | Fisher Bioreagents | BP906-5 | |
| LB agar | Fisher Bioreagents | BP1425-500 | |
| Lysogeny broth | Fisher Bioreagents | BP1426-500 | |
| MgCl2 | Fisher Chemical | ||
| NanoDrop ND-1000 | Thermo Scientific | spectrophotometer | |
| promega luciferase assay system | Promega | E1501 | Cell lysis buffer & luciferin substrate |
| Random Hexamers | Thermo Scientific | SO142 | |
| Real-time GAPDH forward primer | 5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC AAAGT-3' |
||
| Real-time GAPDH reverse primer | 5-'CCCACTCCTCCACCT TTGAC-3' |
||
| Real-time IL-23 forward primer | 5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC TGAT-3' |
||
| Real-time IL-23 reverse primer | 5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3' | ||
| Real-time IL-6 forward primer | 5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3' | ||
| Real-time IL-6 reverse primer | 5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG GCTG-3' |
||
| Reverse Transcriptase | Applied Biosystems | 4308228 | |
| RNAse inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | |
| RT buffer | Promega | A3561 | |
| SL1344 | Ref # 17 | ||
| SL1344 ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 | Ref # 18 | ||
| SL1344 ΔsopE ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 | Ref # 18 | ||
| SYBR green | Applied Biosystems | 4309155 | 2x mastermix |
| Tri-reagent | Molecular Research Center | TR 118 | guanidine thiocyanate |
| Trypsin -EDTA | Thermo Fisher | 25300054 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| ultrapure water | Fisher Bioreagents | BP248450 | |
| Well plate for PCR | VWR International | 89218-294 | 384-well plate |
Referências
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