Hele mount immunohistochemie in zebravissen embryo's en larven
Summary
Hier presenteren we een protocol voor fluorescerende antilichaamgemedieerde detectie van eiwitten in hele preparaten van zebravissen embryo’s en larven.
Abstract
Immunohistochemie is een veel gebruikte techniek om eiwitexpressie en lokalisatie te verkennen tijdens zowel normale ontwikkelings- als ziektetoestanden. Hoewel veel immunohistochemie protocollen zijn geoptimaliseerd voor weefsel- en weefselsecties van zoogdieren, vereisen deze protocollen vaak modificatie en optimalisatie voor niet-zoogdiermodelorganismen. Zebravissen worden steeds vaker gebruikt als een modelsysteem in fundamenteel, biomedisch en translationeel onderzoek om de moleculaire, genetische en celbiologische mechanismen van ontwikkelingsprocessen te onderzoeken. Zebravissen bieden veel voordelen als modelsysteem, maar vereisen ook aangepaste technieken voor optimale eiwitdetectie. Hier bieden we ons protocol voor de gehele mount fluorescentie immunohistochemie in zebravissen embryo’s en larven. Dit protocol beschrijft bovendien verschillende montagestrategieën die kunnen worden gebruikt en een overzicht van de voor- en nadelen die elke strategie biedt. We beschrijven ook wijzigingen in dit protocol om detectie van chromogene substraten in hele mountweefsel en fluorescentiedetectie in gesectioneerd larveweefsel mogelijk te maken. Dit protocol is in grote lijnen van toepassing op de studie van vele ontwikkelingsstadia en embryonale structuren.
Introduction
De zebravis (Danio rerio) is ontstaan als een krachtig model voor de studie van biologische processen om verschillende redenen, waaronder korte generatie tijd, snelle ontwikkeling, en beaambaarheid aan genetische technieken. Als gevolg hiervan worden zebravissen vaak gebruikt in hoge doorvoer kleine molecuul schermen voor toxicologisch onderzoek en drugs ontdekking. Zebravissen zijn ook een aantrekkelijk model voor de studie van ontwikkelingsprocessen, aangezien één vrouwtje routinematig 50-300 eieren tegelijk kan produceren en de optisch heldere embryo’s zich extern ontwikkelen, waardoor ontwikkelingsprocessen efficiënt kunnen worden gevisualerd. Echter, vroeg onderzoek baseerde zich meestal op voorwaartse genetische schermen met behulp van N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) of andere mutageens als gevolg van uitdagingen bij het vaststellen van omgekeerde genetische technieken. Ongeveer twee decennia geleden werden morpholinos voor het eerst gebruikt bij zebravissen om gerichte genen neer te halen1. Morpholinos zijn kleine antisense oligonucleotiden die de vertaling van doelmRNA remmen na micro-injectie in een embryo in een vroeg ontwikkelingsstadium. Een grote zwakte van morpholinos is dat ze worden verdund als de cellen te verdelen en over het algemeen verliezen effectiviteit door 72 uur na de bevruchting (hpf). Terwijl morpholinos een krachtig instrument blijven voor verstoring van het zebravisgen, worden transcriptionor-achtige effector nucleases (TALENs), zink-vinger nucleases (ZFNs), en geclusterd regelmatig interspaced korte palindromic herhalingen (CRISPRs) meer recent gebruikt om direct gericht op de zebravis genoom2,3. Deze omgekeerde genetische strategieën, in combinatie met voorwaartse genetica en hoge doorvoerschermen, hebben de zebravissen vastgesteld als een krachtig model om genexpressie en functie te bestuderen.
De capaciteit om genfunctie te bestuderen vereist over het algemeen een evaluatie van de spatio-tijdelijke distributie van gen of genproductuitdrukking. De twee meest gebruikte technieken om dergelijke expressiepatronen te visualiseren tijdens de vroege ontwikkeling zijn in situ hybridisatie (ISH) en hele mount immunohistochemie (IHC). In situ hybridisatie werd voor het eerst ontwikkeld in 1969 en is gebaseerd op het gebruik van gelabelde antisense RNA sondes om mRNA expressie in een organisme te detecteren4. In tegenstelling, gelabelde antilichamen worden gebruikt in immunohistochemie om eiwitexpressie te visualiseren. Het idee van het etiketteren van eiwitten voor detectie dateert uit de jaren 19305 en de eerste IHC experiment werd gepubliceerd in 1941 toen FITC-gelabelde antilichamen werden gebruikt om pathogene bacteriën in geïnfecteerde weefsels op te sporen6. ISH en IHC zijn in de daaropvolgende decennia sterk geëvolueerd en verbeterd en worden nu zowel routinematig gebruikt in het moleculaire en diagnostische onderzoekslaboratorium7,8,9,10,11. Hoewel beide technieken voor- en nadelen hebben, biedt IHC verschillende voordelen ten opzichte van ISH. Praktisch, IHC is veel minder tijdrovend dan ISH en is over het algemeen minder duur, afhankelijk van de kosten van de primaire antilichaam. Bovendien, mRNA expressie is niet altijd een betrouwbare metrische van eiwitexpressie als het is aangetoond bij muizen en mensen dat slechts ongeveer een derde van de eiwit overvloed variatie kan worden verklaard door mRNA overvloed12. Om deze reden is IHC een belangrijk supplement om ISH-gegevens te bevestigen, indien mogelijk. Ten slotte kan IHC subcellulaire en co-lokalisatiegegevens verstrekken die niet kunnen worden bepaald door ISH13,14,15. Hier beschrijven we een stapsgewijze methode om eiwitten betrouwbaar te detecteren door immunohistochemie in hele mount zebravisembryo’s en larven. Het doel van deze techniek is het bepalen van de ruimtelijke en temporele expressie van een eiwit van belang in het hele embryo. Deze technologie maakt gebruik van antigeenspecifieke primaire antilichamen en fluorescerend gelabelde secundaire antilichamen. Het protocol is gemakkelijk aan te passen aan gebruik op dia-gemonteerde weefselsecties en voor gebruik met chromogene substraten in plaats van fluorescentie. Met behulp van dit protocol, we aantonen dat de ontwikkeling van zebravissen skeletspier drukt ionotropische glutamaat receptoren, in aanvulling op acetylcholine receptoren. NMDA-type glutamaat receptor subunits zijn detecteerbaar op de longitudinale spier op 23 pkf.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immunohistochemie is een veelzijdig hulpmiddel dat kan worden gebruikt om de spatio-temporele expressie van vrijwel elk eiwit van belang in een organisme te karakteriseren. Immunohistochemie wordt gebruikt op een breed scala aan weefsels en modelorganismen. Dit protocol is geoptimaliseerd voor gebruik bij zebravissen. Immunohistochemie bij verschillende soorten kan verschillende fixatie- en behandelingstechnieken vereisen, waardoor oplossingen worden geblokkeerd, afhankelijk van soorten en de aanwezigheid van endogene pe…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiering van NIH subsidie 8P20GM103436 14.
Materials
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| Aluminum foil, heavy duty | Kirkland | Any brand may be substituted | |
| Anti-NMDA antibody | Millipore Sigma | MAB363 | |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002 | Millipore Sigma | 05-598 | |
| Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4) | Millipore Sigma | MABN832 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Calcium Nitrate [Ca(NO3)2] | Sigma Aldrich | C4955 | |
| Centrifuge tubes, 1.5 mL | Axygen | MCT150C | |
| Clear nail polish | Sally Hanson | Any nail polish or hardener may be subsituted | |
| Depression (concavity) slide | Electron Miscroscopy Sciences | 71878-01 | |
| Diaminobenzidine | Thermo Scientific | 1855920 | |
| Embryo medium, Danieau, 30% | 17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water. | ||
| Embryo medium, E2 | 7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 uM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue | ||
| Floating tube holder | Thermo Scientific | 59744015 | |
| Fluorescence compound microscope | Leica Biosystems | DMi8 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica Biosystems | M165-FC | |
| Glass coverslips 18 x 18 | Corning | 284518 | |
| Glass coverslips 22 x 60 | Thermo Scientific | 22-050-222 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Invitrogen | A11001 | |
| HEPES solution | Sigma Aldrich | H0887 | |
| Humid chamber with lid | Simport | M920-2 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Immunedge pap pen | Vector labs | H-4000 | |
| Insect pins, size 00 | Stoelting | 5213323 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4 · 7H2O) | Sigma Aldrich | 63138 | |
| Mesh strainer | Oneida | Any brand may be substituted | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| Methylene blue | Sigma Aldrich | M9140 | |
| Micro-tube cap lock | Research Products International | 145062 | |
| Microwave oven | Toastmaster | ||
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I8765 | |
| Normal goat serum | Millipore Sigma | S02L1ML | |
| Nutating mixer | Fisher Scientific | 88-861-044 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| PBTriton | 1% TritonX-100 in 1x PBS | ||
| Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-500 | |
| Petri dish (glass) | Pyrex | 3160100 | |
| Petri dish (plastic) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 1-phenyl 2-thiourea | Acros Organics | 207250250 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 1x | 1x made from 10x stock diluted in dH2O | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P9333 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher | P250-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | S7907 | |
| Spawning tank with lid and insert | Aquaneering | ZHCT100 | |
| SuperBlock PBS | Thermo Scientific | 37515 | |
| Superfrost + slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superglue gel | 3M Scotch | ||
| TNT | 100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O | ||
| Transfer pipette | Fisher | 13-711-7M | |
| Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH) | Sigma Aldrich | T6399 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | S374-500 | |
| TritonX-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Ultrafine forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
| Water, ultrapure/double distilled | Fisher Scientific | W2-20 |
Referências
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
- Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- van der Ploeg, M. Cytochemical nucleic acid research during the twentieth century. European Journal of Histochemistry. 44 (1), 7-42 (2000).
- Marrack, J. Nature of Antibodies. Nature. 133 (3356), 292-293 (1934).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Lopez, M. E. Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections. Bio-protocol. 4 (18), (2014).
- Morimoto, M., Morita, N., Ozawa, H., Yokoyama, K., Kawata, M. Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study. Neuroscience Research. 26 (3), 235-269 (1996).
- Newton, S. S., Dow, A., Terwilliger, R., Duman, R. A simplified method for combined immunohistochemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse brain sections. Brain Research Protocols. 9 (3), 214-219 (2002).
- Corthell, J. T., Corthell, J. T. . Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 105-111 (2014).
- Corthell, J. T., Corthell, J. T. . Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 91-103 (2014).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).
- Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines. Islets. 6 (4), e982376 (2014).
- Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. M. Glis3 is associated with primary cilia and Wwtr1/TAZ and implicated in polycystic kidney disease. Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2556-2569 (2009).
- Billova, S., Galanopoulou, A. S., Seidah, N. G., Qiu, X., Kumar, U. Immunohistochemical expression and colocalization of somatostatin, carboxypeptidase-E and prohormone convertases 1 and 2 in rat brain. Neurociência. 147 (2), 403-418 (2007).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2000).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).
- Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
- Brennan, C., Mangoli, M., Dyer, C. E. F., Ashworth, R. Acetylcholine and calcium signalling regulates muscle fibre formation in the zebrafish embryo. Journal of Cell Science. 118 (22), 5181 (2005).
- Liu, D. W., Westerfield, M. Clustering of muscle acetylcholine receptors requires motoneurons in live embryos, but not in cell culture. The Journal of Neuroscience. 12 (5), 1859 (1992).
- Borodinsky, L. N., Spitzer, N. C. Activity-dependent neurotransmitter-receptor matching at the neuromuscular junction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 335-340 (2007).
- Brunelli, G., et al. Glutamatergic reinnervation through peripheral nerve graft dictates assembly of glutamatergic synapses at rat skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8752-8757 (2005).
- Hans, F., Dimitrov, S. Histone H3 phosphorylation and cell division. Oncogene. 20 (24), 3021-3027 (2001).
- Yee, N. S., Pack, M. Zebrafish as a model for pancreatic cancer research. Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).
- Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
- Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299 (Pt A), 157-171 (2018).
- Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO journal. 37 (1), 139-159 (2018).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development genes and evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
- Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo. Biochemical pharmacology. 68 (1), 63-71 (2004).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS one. 6 (8), e22991 (2011).
- Inoue, D., Wittbrodt, J. One for all–a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos. PLoS One. 6 (5), e19713 (2011).
