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Pesquisa do Câncer

배열된 라이브러리의 중간 처리량 스크리닝및 이중 루시퍼라제 기반 리포터를 이용한 전사 계수 조절기 식별

Published: March 27, 2020
doi:
10.3791/60582
,
1Department of Molecular & Cellular Physiology,Albany Medical College

Summary

전사 인자의 새로운 조절자를 확인하기 위해, 우리는 이중 luciferase 기반 의 전사 기자 분석을 사용하여 배열 된 렌티 바이러스 또는 레트로 바이러스 RNAi 라이브러리를 선별하는 접근 법을 개발했습니다. 이 방법은 단일 실험에서 수백 개의 후보를 선별하는 빠르고 비교적 저렴한 방법을 제공합니다.

Abstract

전사 인자는 항암 치료에 대한 좋은 표적을 만드는 다양한 다운스트림 과정에 영향을 미치는 수많은 표적 유전자의 발현을 바꿀 수 있습니다. 그러나, 직접 표적화 전사 인자는 종종 어렵고 전사 인자가 하나 이상의 성인 조직에서 필요한 경우 부작용을 일으킬 수 있다. 암세포에서 전사 인자를 비정상적으로 활성화시키는 업스트림 레귤레이터를 식별하는 것은 특히 이러한 단백질이 약물이 쉬운 경우 보다 실현 가능한 대안을 제공합니다. 여기서, 우리는 암세포에서 전사 인자의 새로운 조절자를 식별하기 위해 배열된 중간 규모의 렌티바이러스 라이브러리 및 이중 루시퍼라제 기반 전사 리포터 분석기를 결합하는데 사용될 수 있는 프로토콜을 기술한다. 우리의 접근은 단 하나 실험에 있는 유전자의 수백을 시험하는 빠르고, 쉽고, 저렴한 쪽을 제안합니다. 이러한 접근법의 사용을 입증하기 위해, 우리는 예관련 단백질(YAP) 및 전사 공동 활성제와 PDZ 결합 모티프(TAZ)의 여러 조절제를 포함하는 배열된 렌티바이러스 RNAi 라이브러리의 스크린을 수행하였고, 이는 하마 통로의 하류 이펙터인 2개의 전사 공동 활성제이다. 그러나, 이 접근은 거의 모든 전사 요인 또는 공동 요인의 레귤레이터를 위해 스크린하기 위하여 수정될 수 있고 또한 CRISPR/CAS9, cDNA, 또는 ORF 라이브러리를 검열하기 위하여 이용될 수 있었습니다.

Introduction

이 분석의 목적은 바이러스 성 라이브러리를 사용하여 상대적으로 빠르고 저렴한 방식으로 전사 인자의 조절자를 식별하는 것입니다. 비정상적인 전사 활성은 암 및 전이1,2,23,34,45,6,,6따라서 암세포에서 전사 인자를 표적으로 하는 것은 유망한 치료 접근법이다. 그러나, 전사 인자는 종종 약리학적으로표적화하기 어렵고 많은 것이 성인 조직에서 정상적인 세포 기능에 요구되며8,,9,,10. 질병을 유도하기 위하여 전사 인자를 비정상적으로 활성화하는 암 관련 통로를 표적으로 하는 것은 보다 적게 가혹한 부작용이 있을 가능성이 있는 더 실행 가능한 접근입니다. 배열된 렌티바이러스 및 레트로바이러스 RNAi, CRISPR/CAS9, cDNA 또는 ORF 라이브러리의 상업적 가용성은 연구원이 단일 실험에서 수많은 유전자의 중요성을 테스트할 수 있게 합니다. 그러나 변경된 전사 활동에 대한 신뢰할 수 있는 판독이 필요합니다.

여기에서, 우리는 암세포에 있는 전사 인자를 조절하는 단백질을 확인하기 위하여 이중 luciferase 기지를 둔 전사 기자 분석및 배열된 lentiviral 도서관의 사용을 기술합니다. 이 분석에서, 표적 암 관련 유전자가 렌티바이러스 전달을 통해 포유류 암 세포로 전달되고 세포는 puromycin을 사용하여 안정된 통합을 위해 선택된다. 세포는 조사되고 있는 전사 인자에 특이적인 프로모터에 의해 구동되는 반딧불 루시퍼라아제를 발현하는 리포터 구조로 다음에 형질감염되고, 조사되고 있는 전사 인자에 반응하지 않는 구성활성 프로모터로부터 레닐라 루시퍼라을 발현하는 제어 컨스트럭트. 우리는 YAP 및 TAZ, 하마 경로8,,10,,11의중요한 다운 스트림 이펙터의 규제 기관에 대한 개념 증명 화면으로이 접근 방식을 보여줍니다. YAP 및 TAZ의 비정상적인 활성은 전이성캐스케이드(11)의 여러 단계를 촉진하고 많은 암11,,12,,13에서관찰된다. 그러나, YAP와 TAZ가 몇몇 암세포에서 비정상적으로 활성화되는 방법은 아직 완전히 이해되지 않습니다. YAP와 TAZ는 DNA를 결합하지 않고, 대신 다른 전사 인자에 의해 발기인에게 모집됩니다. 전사 인자의 TEA 도메인 (TEAD) 가족의 구성원은 YAP 및 TAZ에 대한 주요 결합 파트너이며 대부분의 YAP 및 TAZ 의존적 기능에 중요합니다. 우리의 기자 구성은 YAP/TAZ-TEAD 반응 프로모터로부터 반딧불 루시퍼라아제를 표현하고 이전 연구는 YAP-TEAD 및 TAZ-TEAD 전사 활성2,,14,,15의변화를 충실하게 검출한다는 것을 입증하였다.

당사의 접근 방식은 신속하고 중간 처리량이며 스크리닝 시설, 자동화 된 로봇 또는 풀링 된 라이브러리의 깊은 시퀀싱이 필요하지 않습니다. 비용은 상대적으로 낮으며 상업적으로 이용 가능한 라이브러리가 많이 있습니다. 필요한 장비와 시약은 또한 대부분의 실험실에서 상대적으로 표준입니다. 루시퍼라제 기반 리포터가 존재하거나 생성되는 경우 거의 모든 전사 계수의 조절자를 스크리브하는 데 사용할 수 있다. 우리는 암세포에 있는 shRNAs를 스크린하기 위하여 이 접근을 이용합니다, 그러나 적당한 효율성으로 형질전환될 수 있는 어떤 세포주든지 배열된 도서관의 어떤 모형든지로 이용될 수 있었습니다.

Protocol

참고: 이 프로토콜의 회로도 요약은 그림 1에나와 있습니다. 1. 렌티 바이러스 벡터 라이브러리 준비 참고 : 시연 된 화면은 96 웰 플레이트에서 글리세롤 주식으로 구입 한 배열 된 shRNA 라이브러리를 사용했지만 라이브러리는 후보 목록을 기반으로 수동으로 조립 할 수도 있습니다. 적절한 컨트롤을 고려하고 라이브러리에 포함해야 ?…

Representative Results

우리의 YAP/TAZ-TEAD 리포터 구조(pGL3-5xMCAT(SV)-492,,14,,15)는반딧불이 루시퍼라아제 유전자를 구동하는 정준적 TEAD 결합 요소(MCAT)15의 5회 반복을 가진 최소한의 SV-49 프로모터를 함유하고 있다(도1). 그것은 PRL-TK 대조군 벡터(Promega)와 함께 세포내로 병용되어, 이는 구?…

Discussion

본 연구에서, 우리는 전사 인자의 새로운 조절자를 식별하고 테스트하는 데 사용할 수있는 이중 luciferase 기반 전사 기자 분석과 함께 배열 된 바이러스 라이브러리의 중간 처리량 스크리닝에 대한 접근법을 보여줍니다. 모든 스크린에 앞서 각 세포주별로 리포터 시스템을 특성화하고 최적화하는 것이 중요합니다. 실험은 리포터가 조사중인 전사 인자의 변경 된 활동에 반응하고 활성의 변화 규모…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 shRNA 벡터의 준비를 지원에 대한 에밀리 노턴과 미카엘란 쿠치아레 – 스툴리그로스에게 감사드립니다. 이 작품은 J.M.L.에 수여 수잔 G. 코멘 경력 촉매 그랜트에 의해 부분적으로 지원되었다 (#CCR17477184).

Materials

2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate USA Scientific 1896-2000 For bacterial mini-prep
Trypsin – 2.50% Gibco 15090-046 Component of trypsin-EDTA
96 well flat bottom white assay plate Corning 3922 For dual-luciferase assay
Ampicillin – 100 mg/ml Sigma-Aldrich 45-10835242001-EA For bacterial mini-prep
Bacto-tryptone – powder Sigma-Aldrich 95039 Component of LB broth
Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop & Glo substrate (reagent B substrate) and Stop & Glo buffer (reagent B buffer) – Kit Promega E1960 For dual-luciferase assay
Dulbecco's phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red – 9.6 g/L Himedia TS1006 For PBS
EDTA – 0.5 M VWR 97061-406 Component of trypsin-EDTA
Ethanol – 100% Pharmco-AAPER 111000200 For bacterial mini-prep
Foetal Bovine Serum – 100% VWR 97068-085 Component of complete growth media
Hexadimethrine bromide (Polybrene) – 8 mg/ml Sigma-Aldrich 45-H9268 For virus infection
HyClone DMEM/High glucose – 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate GE Healthcare life sciences SH30243.01 Component of complete growth media
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA Molecular devices For dual-luciferase assay
L-Glutamine – 200 mM Gibco 25030-081 Component of complete growth media
Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) – 100% Life technologies L3000008 For transfections
Molecular Biology Water – 100% VWR 02-0201-0500 For dilution of shRNA vector for virus packaging
NaCl – powder BDH BDH9286 Component of LB broth
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo scientific For measuring vector DNA concentration
Opti-MEM (Transfection Buffer) – 100% Gibco 31985-062 For transfections
Penicillin Streptomycin – 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 µg/ml (Streptomycin) Gibco 15140-122 Component of complete growth media
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit – Kit Thermo Fisher Scientific K210010 For bacterial mini-prep
Puromycin – 2.5 mg/ml Sigma-Aldrich 45-P7255 For antibiotic selection after infection
TC20 automated cell counter Bio-Rad For cell counting
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) – 100% Roche 6365787001 For virus packaging
Yeast extract – powder VWR J850 Component of LB broth
P3000 (Transfection Reagent 3) – 100% Life technologies L3000008 For transfections
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Referências

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Xiao, Y., Lamar, J. M. Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter. J. Vis. Exp. (157), e60582, doi:10.3791/60582 (2020).
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