Identifikasjon av transkripsjonsfaktorregulatorer ved hjelp av middels gjennomstrømningsscreening av arrayed biblioteker og en Dual-Luciferase-basert reporter
Summary
For å identifisere nye regulatorer av transkripsjonsfaktorer utviklet vi en tilnærming til skjermarrayed lentivirale eller retrovirale RNAi-biblioteker ved hjelp av en dual-luciferase-basert transkripsjonsreporteranalyse. Denne tilnærmingen tilbyr en rask og relativt billig måte å screene hundrevis av kandidater i et enkelt eksperiment.
Abstract
Transkripsjonsfaktorer kan endre uttrykket for en rekke målgener som påvirker en rekke nedstrømsprosesser, noe som gjør dem gode mål for anti-kreftterapi. Direkte målretting av transkripsjonsfaktorer er imidlertid ofte vanskelig og kan forårsake uønskede bivirkninger hvis transkripsjonsfaktoren er nødvendig i ett eller flere voksne vev. Identifisere oppstrøms regulatorer som avvikende aktivere transkripsjon faktorer i kreftceller tilbyr et mer gjennomførbart alternativ, spesielt hvis disse proteinene er lett å narkotika. Her beskriver vi en protokoll som kan brukes til å kombinere arrayed medium-scale lentiviral biblioteker og en dual-luciferase-basert transkripsjonsreporter analyse for å identifisere nye regulatorer av transkripsjonsfaktorer i kreftceller. Vår tilnærming tilbyr en rask, enkel og rimelig måte å teste hundrevis av gener i et enkelt eksperiment. For å demonstrere bruken av denne tilnærmingen utførte vi en skjerm av et arrayed lentiviral RNAi-bibliotek som inneholder flere regulatorer av Ja-assosiert protein (YAP) og transkripsjonskoaktivator med PDZ-bindende motiv (TAZ), to transkripsjonelle koaktivatorer som er de nedstrøms effektorene på Hippo-banen. Denne tilnærmingen kan imidlertid endres til skjerm for regulatorer av nesten alle transkripsjonsfaktorer eller medfaktor, og kan også brukes til å screene CRISPR/CAS9,cDNA eller ORF-biblioteker.
Introduction
Formålet med denne analysen er å bruke virale biblioteker for å identifisere regulatorer av transkripsjonsfaktorer på en relativt rask og rimelig måte. Avvikende transkripsjonsaktivitet er forbundet med kreft og metastase1,2,3,4,5,6, så målretting transkripsjonfaktorer i kreftceller er en lovende terapeutisk tilnærming. Transkripsjonsfaktorer er imidlertid ofte vanskelige å målrette farmakologisk7, og mange er nødvendige for normal cellulær funksjon i voksenvev8,9,10. Målretting mot kreftrelaterte veier som avvikende aktiverer transkripsjonsfaktorer for å drive sykdom, er en mer mulig tilnærming med potensial til å ha mindre alvorlige bivirkninger. Den kommersielle tilgjengeligheten av arrayed lentiviral og retroviral RNAi, CRISPR/ CAS9, cDNA eller ORF biblioteker gjør det mulig for forskere å teste viktigheten av mange gener i et enkelt eksperiment. En pålitelig avlesning for endret transkripsjonsaktivitet er imidlertid nødvendig.
Her beskriver vi bruken av en dual-luciferase-basert transkripsjonsreporteranalyse og arrayed lentivirale biblioteker for å identifisere proteiner som regulerer transkripsjonsfaktorer i kreftceller. I denne analysen er shRNAs som retter seg mot kreftrelaterte gener levert til pattedyrkreftceller via lentiviral transduksjon og celler valgt for stabil integrasjon ved hjelp av puromycin. Cellene er neste transfected med en reporter konstruksjon som uttrykker firefly luciferase drevet av en arrangør som er spesifikk for transkripsjonsfaktoren som undersøkes og en kontrollkonstruksjon som uttrykker Renilla luciferase fra en konstitutivt aktiv arrangør som ikke reagerer på transkripsjonsfaktoren som undersøkes. Vi demonstrerer denne tilnærmingen med en konseptbevisskjerm for regulatorer av YAP og TAZ, de kritiske nedstrømseffektorene av Hippo-banen8,,10,11. Unormal aktivitet av YAP og TAZ fremmer flere trinn av metastatisk kaskade11 og observeres i mange kreftformer11,12,13. Men hvordan YAP og TAZ blir avvikende aktivert i noen kreftceller er ennå ikke fullt ut forstått. YAP og TAZ binder ikke DNA, men rekrutteres i stedet til arrangører av andre transkripsjonsfaktorer. Medlemmer av TEA-domenet (TEAD) familie av transkripsjonsfaktorer er de viktigste bindende partnerne for YAP og TAZ, og er kritiske for de fleste YAP- og TAZ-avhengige funksjoner. Vår reporter konstruere uttrykker firefly luciferase fra en YAP / TAZ-TEAD-responsive arrangør og tidligere studier har vist at det trofast oppdager endringer i YAP-TEAD og TAZ-TEAD transkripsjonsaktivitet2,14,15.
Vår tilnærming er rask, middels gjennomstrømning, og krever ikke screeningfasiliteter, automatiserte roboter eller dyp sekvensering av samlede biblioteker. Kostnadene er relativt lave og det er mange kommersielt tilgjengelige biblioteker å velge mellom. Nødvendig utstyr og reagenser er også relativt standard i de fleste laboratorier. Den kan brukes til å screene for regulatorer av nesten enhver transkripsjonsfaktor hvis en luciferase-basert reporter eksisterer eller genereres. Vi bruker denne tilnærmingen til å screene shRNAs i kreftceller, men enhver cellelinje som kan transfected med rimelig effektivitet kan brukes med alle typer arrayed bibliotek.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne studien viser vi en tilnærming til middels gjennomstrømning screening av arrayed viral biblioteker i kombinasjon med en dual-luciferase-basert transkripsjonsreporter analyse som kan brukes til å identifisere og teste nye regulatorer av transkripsjonsfaktorer. Det er avgjørende å karakterisere og optimalisere reportersystemet for hver cellelinje før en skjerm. Eksperimenter bør gjøres for å bekrefte at reporteren reagerer på endret aktivitet av transkripsjonsfaktoren som undersøkes, og omfanget av endri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke Emily Norton og Mikaelan Cucciarre-Stuligross for å ha hjulpet til med utarbeidelsen av shRNA-vektorer. Dette arbeidet ble delvis støttet av en Susan G. Komen Career Catalyst Grant som tildeles J.M.L. (#CCR17477184).
Materials
| 2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate | USA Scientific | 1896-2000 | For bacterial mini-prep |
| Trypsin – 2.50% | Gibco | 15090-046 | Component of trypsin-EDTA |
| 96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For dual-luciferase assay |
| Ampicillin – 100 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-10835242001-EA | For bacterial mini-prep |
| Bacto-tryptone – powder | Sigma-Aldrich | 95039 | Component of LB broth |
| Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop & Glo substrate (reagent B substrate) and Stop & Glo buffer (reagent B buffer) – Kit | Promega | E1960 | For dual-luciferase assay |
| Dulbecco's phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red – 9.6 g/L | Himedia | TS1006 | For PBS |
| EDTA – 0.5 M | VWR | 97061-406 | Component of trypsin-EDTA |
| Ethanol – 100% | Pharmco-AAPER | 111000200 | For bacterial mini-prep |
| Foetal Bovine Serum – 100% | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) – 8 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For virus infection |
| HyClone DMEM/High glucose – 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
| I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For dual-luciferase assay | |
| L-Glutamine – 200 mM | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
| Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) – 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
| Molecular Biology Water – 100% | VWR | 02-0201-0500 | For dilution of shRNA vector for virus packaging |
| NaCl – powder | BDH | BDH9286 | Component of LB broth |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo scientific | For measuring vector DNA concentration | |
| Opti-MEM (Transfection Buffer) – 100% | Gibco | 31985-062 | For transfections |
| Penicillin Streptomycin – 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 µg/ml (Streptomycin) | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit – Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | For bacterial mini-prep |
| Puromycin – 2.5 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection after infection |
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For cell counting | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) – 100% | Roche | 6365787001 | For virus packaging |
| Yeast extract – powder | VWR | J850 | Component of LB broth |
| P3000 (Transfection Reagent 3) – 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
References
- Chen, K. S., Lim, J. W. C., Richards, L. J., Bunt, J. The convergent roles of the nuclear factor I transcription factors in development and cancer. Cancer Letters. 410, 124-138 (2017).
- Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), E2441-E2450 (2012).
- Liu, C. Y., Yu, T., Huang, Y., Cui, L., Hong, W. ETS (E26 transformation-specific) up-regulation of the transcriptional co-activator TAZ promotes cell migration and metastasis in prostate cancer. Journal of Biological Chemistry. 292 (22), 9420-9430 (2017).
- Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1: oxygen homeostasis and disease pathophysiology. Trends in Molecular Medicine. 7 (8), 345-350 (2001).
- Willmer, T., Cooper, A., Peres, J., Omar, R., Prince, S. The T-Box transcription factor 3 in development and cancer. Bioscience Trends. 11 (3), 254-266 (2017).
- Zhu, C., Li, L., Zhao, B. The regulation and function of YAP transcription co-activator. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 47 (1), 16-28 (2015).
- Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the ‘undruggable’ cancer targets. Nature Reviews: Cancer. 17 (8), 502-508 (2017).
- Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
- Hansen, C. G., Moroishi, T., Guan, K. L. YAP and TAZ: a nexus for Hippo signaling and beyond. Trends in Cell Biology. 25 (9), 499-513 (2015).
- Yu, F. X., Zhao, B., Guan, K. L. Hippo Pathway in Organ Size Control, Tissue Homeostasis, and Cancer. Cell. 163 (4), 811-828 (2015).
- Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers. 10 (4), (2018).
- Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
- Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. YAP/TAZ at the Roots of Cancer. Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).
- Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
- Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 217-225 (2005).
- Codelia, V. A., Sun, G., Irvine, K. D. Regulation of YAP by mechanical strain through Jnk and Hippo signaling. Current Biology. 24 (17), 2012-2017 (2014).
- Cosset, E., et al. Glut3 Addiction Is a Druggable Vulnerability for a Molecularly Defined Subpopulation of Glioblastoma. Cancer Cell. 32 (6), 856-868 (2017).
- de Cristofaro, T., et al. TAZ/WWTR1 is overexpressed in papillary thyroid carcinoma. European Journal of Cancer. 47 (6), 926-933 (2011).
- Densham, R. M., et al. MST kinases monitor actin cytoskeletal integrity and signal via c-Jun N-terminal kinase stress-activated kinase to regulate p21Waf1/Cip1 stability. Molecular and Cellular Biology. 29 (24), 6380-6390 (2009).
- Eda, H., Aoki, K., Marumo, K., Fujii, K., Ohkawa, K. FGF-2 signaling induces downregulation of TAZ protein in osteoblastic MC3T3-E1 cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 366 (2), 471-475 (2008).
- Elbediwy, A., et al. Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis. Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).
- Enomoto, M., Igaki, T. Src controls tumorigenesis via JNK-dependent regulation of the Hippo pathway in Drosophila. EMBO Reports. 14 (1), 65-72 (2013).
- Enomoto, M., Kizawa, D., Ohsawa, S., Igaki, T. JNK signaling is converted from anti- to pro-tumor pathway by Ras-mediated switch of Warts activity. Developmental Biology. 403 (2), 162-171 (2015).
- Fan, R., Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Regulation of Hippo pathway by mitogenic growth factors via phosphoinositide 3-kinase and phosphoinositide-dependent kinase-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (7), 2569-2574 (2013).
- Feng, R., et al. MAPK and Hippo signaling pathways crosstalk via the RAF-1/MST-2 interaction in malignant melanoma. Oncology Reports. 38 (2), 1199-1205 (2017).
- Fisher, M. L., et al. Transglutaminase Interaction with alpha6/beta4-Integrin Stimulates YAP1-Dependent DeltaNp63alpha Stabilization and Leads to Enhanced Cancer Stem Cell Survival and Tumor Formation. Cancer Research. 76 (24), 7265-7276 (2016).
- Haskins, J. W., Nguyen, D. X., Stern, D. F. Neuregulin 1-activated ERBB4 interacts with YAP to induce Hippo pathway target genes and promote cell migration. Science Signaling. 7 (355), (2014).
- Hoeing, K., et al. Presenilin-1 processing of ErbB4 in fetal type II cells is necessary for control of fetal lung maturation. Biochimica et Biophysica Acta. 1813 (3), 480-491 (2011).
- Hwang, J. H., et al. Extracellular Matrix Stiffness Regulates Osteogenic Differentiation through MAPK Activation. PloS One. 10 (8), e0135519 (2015).
- Kaneko, K., Ito, M., Naoe, Y., Lacy-Hulbert, A., Ikeda, K. Integrin alphav in the mechanical response of osteoblast lineage cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 447 (2), 352-357 (2014).
- Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Adhesion to fibronectin regulates Hippo signaling via the FAK-Src-PI3K pathway. Journal of Cell Biology. 210 (3), 503-515 (2015).
- Kuser-Abali, G., Alptekin, A., Cinar, B. Overexpression of MYC and EZH2 cooperates to epigenetically silence MST1 expression. Epigenetics. 9 (4), 634-643 (2014).
- Liu, N., et al. HDM2 Promotes NEDDylation of Hepatitis B Virus HBx To Enhance Its Stability and Function. Journal of Virology. 91 (16), (2017).
- Liu, X., et al. The EZH2- H3K27me3-DNMT1 complex orchestrates epigenetic silencing of the wwc1 gene, a Hippo/YAP pathway upstream effector, in breast cancer epithelial cells. Cellular Signalling. 51, 243-256 (2018).
- Omerovic, J., et al. Ligand-regulated association of ErbB-4 to the transcriptional co-activator YAP65 controls transcription at the nuclear level. Experimental Cell Research. 294 (2), 469-479 (2004).
- Pegoraro, S., et al. A novel HMGA1-CCNE2-YAP axis regulates breast cancer aggressiveness. Oncotarget. 6 (22), 19087-19101 (2015).
- Xia, H., et al. EGFR-PI3K-PDK1 pathway regulates YAP signaling in hepatocellular carcinoma: the mechanism and its implications in targeted therapy. Cell Death & Disease. 9 (3), 269 (2018).
- Yan, F., et al. ErbB4 protects against neuronal apoptosis via activation of YAP/PIK3CB signaling pathway in a rat model of subarachnoid hemorrhage. Experimental Neurology. 297, 92-100 (2017).
- Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
- Bonilla, X., et al. Genomic analysis identifies new drivers and progression pathways in skin basal cell carcinoma. Nature Genetics. 48 (4), 398-406 (2016).
- Enger, T. B., et al. The Hippo signaling pathway is required for salivary gland development and its dysregulation is associated with Sjogren’s syndrome. Laboratory Investigation. 93 (11), 1203-1218 (2013).
- Fausti, F., et al. ATM kinase enables the functional axis of YAP, PML and p53 to ameliorate loss of Werner protein-mediated oncogenic senescence. Cell Death and Differentiation. 20 (11), 1498-1509 (2013).
- He, J., et al. Positive regulation of TAZ expression by EBV-LMP1 contributes to cell proliferation and epithelial-mesenchymal transition in nasopharyngeal carcinoma. Oncotarget. 8 (32), 52333-52344 (2017).
- Huang, W., et al. The N-terminal phosphodegron targets TAZ/WWTR1 protein for SCFbeta-TrCP-dependent degradation in response to phosphatidylinositol 3-kinase inhibition. Journal of Biological Chemistry. 287 (31), 26245-26253 (2012).
- Imada, S., et al. Role of Src Family Kinases in Regulation of Intestinal Epithelial Homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 36 (22), 2811-2823 (2016).
- Kim, N. G., Koh, E., Chen, X., Gumbiner, B. M. E-cadherin mediates contact inhibition of proliferation through Hippo signaling-pathway components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (29), 11930-11935 (2011).
- Lai, J. K. H., et al. The Hippo pathway effector Wwtr1 regulates cardiac wall maturation in zebrafish. Development. 145 (10), (2018).
- Li, H., Gumbiner, B. M. Deregulation of the Hippo pathway in mouse mammary stem cells promotes mammary tumorigenesis. Mammalian Genome. 27 (11-12), 556-564 (2016).
- Pefani, D. E., O’Neill, E. Hippo pathway and protection of genome stability in response to DNA damage. The FEBS Journal. 283 (8), 1392-1403 (2016).
- Serrano, I., McDonald, P. C., Lock, F., Muller, W. J., Dedhar, S. Inactivation of the Hippo tumour suppressor pathway by integrin-linked kinase. Nature Communications. 4, 2976 (2013).
- Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
- Xie, Q., et al. YAP/TEAD-mediated transcription controls cellular senescence. Cancer Research. 73 (12), 3615-3624 (2013).
- Yee, K. S., et al. A RASSF1A polymorphism restricts p53/p73 activation and associates with poor survival and accelerated age of onset of soft tissue sarcoma. Cancer Research. 72 (9), 2206-2217 (2012).
- Zhou, Z., et al. Oncogenic Kinase-Induced PKM2 Tyrosine 105 Phosphorylation Converts Nononcogenic PKM2 to a Tumor Promoter and Induces Cancer Stem-like Cells. Cancer Research. 78 (9), 2248-2261 (2018).
- Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. Journal of Visualized Experiments. (88), (2014).
