Préparation d'échantillons dans Quartz Crystal Microbalance Measurements of Protein Adsorption and Polymer Mechanics

Summary

Le microbalance de cristal de quartz peut fournir la masse précise et les propriétés viscoélastiques pour des films dans la gamme de micron ou de submicron, qui est pertinent pour des investigations dans la détection biomédicale et environnementale, les revêtements, et la science de polymère. L’épaisseur de l’échantillon influence les informations qui peuvent être obtenues à partir du matériau en contact avec le capteur.

Abstract

Dans cette étude, nous présentons divers exemples de la façon dont la préparation mince du film pour les expériences de microbalance cristal l’indique la modélisation appropriée des données et détermine quelles propriétés du film peuvent être quantifiées. Le microbalance de cristal de quartz offre une plate-forme particulièrement sensible pour mesurer les changements fins dans la masse et/ou les propriétés mécaniques d’un film appliqué en observant les changements dans la résonance mécanique d’un cristal de quartz oscillant à haute fréquence. Les avantages de cette approche comprennent sa polyvalence expérimentale, sa capacité d’étudier les changements de propriétés sur un large éventail de durées expérimentales et l’utilisation de petites tailles d’échantillons. Nous démontrons que, en fonction de l’épaisseur et du modulus de cisaillement de la couche déposée sur le capteur, nous pouvons acquérir différentes informations à partir du matériau. Ici, ce concept est spécifiquement exploité pour afficher des paramètres expérimentaux résultant en des calculs de masse et viscoélastiques de collagène adsorbed sur l’or et les complexes de polyélectrolyte pendant le gonflement en fonction de la concentration de sel.

Introduction

Le microbalance de cristal de quartz (QCM) tire parti de l’effet piézoélectrique d’un cristal de quartz pour surveiller sa fréquence de résonance, qui dépend de la masse adhérée à la surface. La technique compare la fréquence et la bande passante résonnantes d’un capteur de cristal de quartz coupé AT (généralement de l’ordre de 5 MHz)¹ dans l’air ou un fluide à la fréquence et à la bande passante du capteur après le dépôt d’un film. Il y a plusieurs avantages à utiliser le QCM pour étudier les propriétés et les interfaces minces de film, y compris la sensibilité élevée à la masse et potentiellement aux changements viscoélastiques de propriété (selon l’uniformité et l’épaisseur d’échantillon), la capacité d’exécuter des études in situ^2,et la capacité de sonder une échelle de temps rhéologique beaucoup plus courte que la rhéologie traditionnelle de cisaillement ou l’analyse mécanique dynamique (DMA). Sonder un court laps de temps rhéologique permet d’observer comment la réponse à cette échelle de temps change à la fois sur des durées extrêmement courtes (ms)³ et longues (années)⁴. Cette capacité est bénéfique pour l’étude d’une variété de processus cinétiques et est également une extension utile des techniques rhéométriques traditionnelles^5,6.

La sensibilité élevée du QCM a également conduit à son utilisation intensive dans des applications biologiques étudiant les interactions fondamentales des biomolécules extrêmement petites. Une surface de capteur non couchée ou fonctionnalisée peut être utilisée pour étudier l’adsorption protéique; encore plus loin, la biodétection par des événements de liaison complexes entre les enzymes, les anticorps et les aptamers peut être examinée en fonction des changements de masse^7,8,9. Par exemple, la technique a été utilisée pour comprendre la transformation des vésicules en une bicouche lipidique planaire comme un processus en deux phases d’adsorption des vésicules contenant du liquide à une structure rigide en observant les changements de corrélation de la fréquence et la viscoélasticité¹⁰. Au cours des dernières années, le QCM a en outre offert une plate-forme robuste pour surveiller l’administration de médicaments par vésicules ou nanoparticules¹¹. À l’intersection de l’ingénierie des matériaux et de la biologie moléculaire et cellulaire, nous pouvons utiliser le QCM pour élucider les interactions clés entre les matériaux et les composants bioactifs comme les protéines, les acides nucléiques, les liposomes et les cellules. Par exemple, l’adsorption protéique à un biomatériau sert de médiateur aux réponses cellulaires en aval comme l’inflammation et est souvent utilisée comme indicateur positif de biocompatibilité, tandis que dans d’autres cas, l’attachement extracellulaire des protéines aux revêtements qui interagissent avec le sang pourrait induire une coagulation dangereuse dans les vaisseaux^12,13. Le QCM peut donc être utilisé comme un outil pour sélectionner les candidats optimaux pour différents besoins.

Deux approches communes pour l’exécution d’expériences QCM recueillent des données analogues de l’expérience : la première approche enregistre le décalage de fréquence et la demi-bande passante() du pic de conductance. La deuxième approche, qcM avec dissipation (QCM-D), enregistre le décalage de fréquence et le facteur de dissipation, qui est directement proportionnel à l’équation 1,¹⁴

(1)

où D est le facteur de dissipation et la fréquence est la fréquence. Les deux D et Les ‘ sont liés à l’effet d’amortissement du film sur le capteur, ce qui donne une indication de la rigidité du film. Le sous-scripte n désigne la fréquence de tonalité ou d’harmonique, qui sont les fréquences de résonance impaires du capteur de quartz (n ‘ 1, 3, 5, 7…). D’autres discussions sur les modèles utilisant plusieurs harmoniques pour obtenir la masse et les propriétés viscoélastiques d’un film peuvent être trouvées dans une critique par Johannsmann¹⁴ et les documents précédents du groupe Shull^15,16,17,18.

Une considération clé pour la préparation des échantillons de QCM est de savoir comment appliquer le film mince sur la surface du capteur. Certaines méthodes courantes incluent le revêtement de spin, revêtement de trempette, revêtement de chute, ou adsorption du film sur la surface du capteur au cours de l’expérience^19,20. Il y a quatre régions pour les échantillons de QCM : la limite de Sauerbrey, le régime viscoélastique, le régime en vrac, et le régime surdalé. Pour les films suffisamment minces, la limite Sauerbrey s’applique, où le décalage de fréquence(en)fournit la densité de masse de surface du film. Dans la limite de Sauerbrey, les échelles de décalage de fréquence linéairement avec l’harmonique résonnante, n, et les changements dans le facteur d’amortissement (D ou )sont généralement petits. Dans ce régime, il n’y a pas suffisamment d’information disponible pour déterminer uniquement les propriétés rhéologiques de la couche sans faire d’hypothèses supplémentaires. Les données de ce régime sont utilisées pour calculer la densité de masse de surface (ou l’épaisseur si la densité est connue a priori) du film. Dans le régime en vrac où le milieu en contact avec le cristal est suffisamment épais, l’onde de cisaillement évanescente se propage dans le milieu avant d’être complètement amortie. Ici, aucune information de masse ne peut être obtenue à l’aide de l’adresse ‘‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ Cependant, dans cette région, les propriétés viscoélastiques sont déterminées de façon fiable à l’aide de la combinaison de 15euros et de¹⁵euros. Dans le régime en vrac, si le support est trop rigide, le film amortira la résonance du capteur, empêchant la collecte de données fiables de la QCM. Le régime viscoélastique est le régime intermédiaire où le film est assez mince pour que l’onde de cisaillement se propage complètement à travers le film ainsi que des valeurs fiables pour le facteur d’amortissement. Le facteur d’amortissement etle facteur d’amortissement et le facteur d’amortissement peuvent ensuite être utilisés pour déterminer les propriétés viscoélastiques du film ainsi que sa masse. Ici, les propriétés viscoélastiques sont données par le produit de la densité et de l’ampleur du modulus complexe de cisaillement. G. p et l’angle de phase donné par ‘arctan’ (G” / G’). Lorsque les films sont préparés dans la limite de Sauerbrey, la masse par unité de surface peut être calculée directement sur la base de l’équation de Sauerbrey montrée ci-dessous²¹,

(2)

où len_est le changement de la fréquence de résonance, n est la tonalité d’intérêt,_{n 1} est la fréquence de résonance du capteur, m / A est la masse par zone du film, et Z_q est l’impedance acoustique du quartz, qui pour AT quartz coupé est Z_q 8,84 x 10⁶kg / m²s. Le régime viscoélastique est le plus approprié pour l’étude des films polymères, et la limite en vrac est utile pour étudier le polymère visqueux²² ou les solutions protéiques¹⁶. Les différents régimes dépendent des propriétés du matériau d’intérêt, avec l’épaisseur optimale pour la caractérisation viscoélastique complète et de masse augmentant généralement avec la rigidité du film. La figure 1 décrit les quatre régions en ce qui concerne la densité aréale du film, le modulus complexe de cisaillement, et l’angle de phase, où nous avons supposé une relation spécifique entre l’angle de phase et la rigidité du film qui s’est avéré pertinent pour les matériaux de ce type. Beaucoup de films d’intérêt pratique sont trop épais pour étudier les propriétés viscoélastiques avec QCM, comme certains biofilms, où les épaisseurs sont de l’ordre de dizaines à des centaines de microns²³. Ces films épais ne sont généralement pas appropriés pour l’étude à l’aide de la QCM, mais peuvent être mesurés à l’aide de résonateurs à basse fréquence (tels que les résonateurs de torsion)²³, permettant à l’onde de cisaillement de se propager plus loin dans le film.

Pour déterminer quel régime est pertinent pour un échantillon qcM donné, il est important de comprendre le paramètre d /_n, qui est le rapport de l’épaisseur du film (d) à la longueur d’onde de cisaillement de l’oscillation mécanique du capteur de cristal de quartz_(n)^15,16,18. Le régime viscoélastique idéal est d /_n – 0,05 – 0,2¹⁸, où les valeurs inférieures à 0,05 sont dans la limite de Sauerbrey et les valeurs supérieures à 0,2 approche nt le régime en vrac. Une description plus rigoureuse de d /_n est fournie ailleurs^15,18, mais il s’agit d’un paramètre quantitatif délimitant la limite Sauerbrey et la limite viscoélastique. Les programmes d’analyse utilisés ci-dessous fournissent ce paramètre directement.

Il y a quelques limites supplémentaires à l’analyse des films minces avec le QCM. Les calculs Sauerbrey et viscoélastique supposent que le film est homogène à la fois tout au long de l’épaisseur du film et latéralement à travers la surface de l’électrode de la QCM. Bien que cette hypothèse rend difficile l’étude des films qui ont des vides ou des charges présentes, il ya eu quelques enquêtes QCM dans les films composés de nanoparticules greffées⁶. Si les hétérogénéités sont faibles par rapport à l’épaisseur globale du film, des propriétés viscoélastiques fiables du système composite peuvent encore être obtenues. Pour les systèmes plus hétérogènes, les valeurs obtenues à partir d’une analyse viscoélastique doivent toujours être considérées avec une grande prudence. Idéalement, les résultats obtenus à partir de systèmes avec une hétérogénéité inconnue devraient être validés contre des systèmes qui sont connus pour être homogènes. C’est l’approche que nous avons adoptée dans le système d’exemple décrit dans le présent document.

Un point important que nous éclairons dans cet article est la correspondance exacte entre les mesures DE QCM effectuées dans le domaine de la fréquence (où est rapporté) et les expériences de domaine temporel (où D est signalé). Les résultats de deux expériences QCM différentes, un domaine temporel et un domaine de fréquence, sont décrits, chacun impliquant un système modèle différent mais conceptuellement lié. Le premier système est un exemple simple d’attachement au collagène au capteur pour illustrer la cinétique de liaison représentative et l’équilibre de l’adsorption au fil du temps au cours d’une mesure de domaine temporel (QCM-D). Le collagène est la protéine la plus abondante dans le corps, connue pour sa polyvalence des comportements de liaison et de morphologie. La solution de collagène utilisée ici ne nécessite pas de fonctionnalisation supplémentaire de la surface d’or du capteur pour induire l’adsorption⁹. Le deuxième système expérimental est un complexe de polyélectrolytes (PEC) composé de sulfonate de polystyrène anionique (PSS) et de poly cationique (diallyldimethylammonium) (PDADMA) préparé de la même manière que Sadman et al.²². Ces matériaux gonflent et deviennent mous dans le sel (KBr dans ce cas) solutions, offrant une plate-forme simple pour étudier la mécanique des polymères en utilisant une approche de domaine de fréquence (QCM-Z). Pour chaque protocole, le processus de préparation, de prise et d’analyse d’une mesure est indiqué à la figure 2. Le schéma montre que la principale différence entre les approches QCM-Z et QCM-D réside dans l’étape de collecte de données et l’instrumentation utilisée dans l’expérience. Toutes les techniques de préparation d’échantillons mentionnées sont compatibles avec les deux approches, et chaque approche peut analyser des échantillons dans les trois régions représentées à la figure 1.

Nos données démontrent que la préparation d’échantillons, que ce soit par revêtement de capteur avant ou pendant une mesure, dicte la capacité d’extraire les propriétés viscoélastiques d’un système. En concevant les premières étapes d’une expérience de manière appropriée, nous pouvons déterminer quelles informations nous pouvons recueillir avec précision au cours de l’étape d’analyse.

Protocol

Adsorption de collagène DE QCM-D 1. Préparation de l’échantillon et pré-nettoyage du capteur Préparer 20 ml de tampon d’acétate de 0,1 M, en ajustant le pH avec HCl et NaOH au besoin pour atteindre le pH 5,6. Ajouter la solution de collagène de queue de rat à la 20 ml de tampon d’acétate dans des conditions stériles à une concentration finale de 10 g/mL. Nettoyer le capteur de quartz enduit d’or pour enlever le matériel organique et bi…

Representative Results

Les changements de fréquence avec le temps pendant l’adsorption protéique présentent une courbe et un plateau caractéristiques montrés dans la figure 3A-B. Le lavage tampon initial de 1x PBS à travers la surface du capteur nu n’induit que des changements négligeables de fréquence, offrant une base de référence stable pour agir comme une référence pour les points de données futurs. L’introduction de la solution de collagène provoque l’adsorption protéique de co…

Discussion

Les résultats d’adsorption de collagène couvrent les régimes sauerbrey et viscoélastique. En traçant les décalages de fréquence normalisés au nombre harmonique correspondant, nous observons que la limite de Sauerbrey est vraie pour environ les 2 premières heures de la mesure. Avec l’augmentation de la masse adhérant au capteur, cependant, les changements de fréquence normalisés pour les troisième et cinquième harmoniques commencent à s’écarter les uns des autres(t ‘gt; 2 h), indiquant une capacit…

Materials

Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283	For collagen adsorption
Ammonium hydroxide solution	Sigma-Aldrich	221228	For collagen adsorption
Aqueous QCM probe	AWSensors	CLS 00050 A	For polyelectrolyte swelling
Collagen I Rat Protein, Tail	Thermo Fisher Scientific	A1048301	For collagen adsorption
Distilled water	Sigma-Aldrich	EM3234	For polyelectrolyte swelling; generally easy to acquire in research labs, but there is a catalog number in case it is not accessible
Ethanol	Sigma-Aldrich	793175-1GA-PB	For polyelectrolyte swelling
Gibco Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific	20012-027	For collagen adsorption
Hellmanex III	Sigma-Aldrich	Z805939	For collagen adsorption
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	216763	For collagen adsorption
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fisher Scientific	06-666A	For polyelectrolyte swelling
NP2K VNA	Makarov Instruments		For polyelectrolyte swelling
Poly(diallyldimethylammonium chloride), MW 200,000	Sigma-Aldrich	409022	For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al.
Poly(styrene-sulfonate) sodium salt 30% weight in water	Sigma-Aldrich	561967-500G	For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al.
Potassium Bromide	Sigma-Aldrich	793604-1KG	For polyelectrolyte swelling
QSense QCM Explorer System	Biolin Scientific		For collagen adsorption
Sodium acetate, anhydrous	Sigma-Aldrich	S2889	For collagen adsorption
Spin coater, Model WS-650MZ-23NPP	Laurell technologies		For polyelectrolyte swelling