Preparazione del campione nella misurazione del microbilanciamento del cristallo di quarzo dell'adsortazione delle proteine e della meccanica dei polimeri

Summary

Il microbilanciamento a cristalli di quarzo può fornire accurate proprietà di massa e viscoelastica per le pellicole nella gamma micron o submicron, che è rilevante per le indagini in biomedica e ambientale rilevamento, rivestimenti e scienza dei polimeri. Lo spessore del campione influenza quali informazioni possono essere ottenute dal materiale a contatto con il sensore.

Abstract

In questo studio, presentiamo vari esempi di come la sottile preparazione della pellicola per gli esperimenti di microbilanciamento del cristallo di quarzo informa la modellazione appropriata dei dati e determina quali proprietà della pellicola possono essere quantificate. Il microbilanciamento a cristalli di quarzo offre una piattaforma particolarmente sensibile per misurare i cambiamenti fini nelle proprietà di massa e/o meccaniche di una pellicola applicata osservando i cambiamenti nella risonanza meccanica di un cristallo di quarzo che oscilla ad alta frequenza. I vantaggi di questo approccio includono la sua versatilità sperimentale, la capacità di studiare i cambiamenti nelle proprietà su una vasta gamma di lunghezze di tempo sperimentali e l’uso di campioni di piccole dimensioni. Dimostriamo che, in base allo spessore e al modulo di taglio dello strato depositato sul sensore, possiamo acquisire informazioni diverse dal materiale. Qui, questo concetto è specificamente sfruttato per visualizzare parametri sperimentali con conseguente calcoli di massa e viscoelastico del collagene adsorbito su complessi oro e poliglitolitico durante il gonfiore in funzione della concentrazione del sale.

Introduction

Il microequilibrio di cristallo di quarzo (QCM) sfrutta l’effetto piezoelettrico di un cristallo di quarzo per monitorare la sua frequenza risonante, che dipende dalla massa aderita alla superficie. La tecnica confronta la frequenza di risonanza e la larghezza di banda di un sensore di cristallo al quarzo taglio AT (tipicamente nell’intervallo di 5 MHz)¹ in aria o un fluido alla frequenza e alla larghezza di banda del sensore dopo la deposizione di una pellicola. Ci sono diversi vantaggi per l’utilizzo del QCM per studiare le proprietà e le interfacce della pellicola sottile, tra cui l’elevata sensibilità alla massa e potenzialmente ai cambiamenti delle proprietà viscoelastice (a seconda dell’uniformità e dello spessore del campione), la capacità di eseguire studi in situ²e la capacità di sondare una scala reologica molto più breve rispetto alla tradizionale reologia di taglio o analisi meccanica dinamica (DMA). Sondare una breve scala temporale reologica permette l’osservazione di come la risposta in questa scala temporale cambia sia su durate estremamente brevi (ms)³ e lunghe (anni)⁴. Questa capacità è utile per lo studio di una varietà di processi cinetici ed è anche un’utile estensione delle tecniche reometriche tradizionali^5,6.

L’elevata sensibilità del QCM ha anche portato al suo uso pesante in applicazioni biologiche studiando le interazioni fondamentali di biomolecole estremamente piccole. Una superficie del sensore non rivestita o funzionalizzata può essere utilizzata per studiare l’adsorbiente delle proteine; ancora più lontano, il biosensing attraverso complessi eventi di legame tra enzimi, anticorpi e aptamers può essere esaminato sulla base di cambiamenti di massa^7,8,9. Per esempio, la tecnica è stata utilizzata per comprendere la trasformazione delle vesciche in un bistrato lipidico planare come un processo in due fasi di adsorbizione di vesciboli contenenti liquidi a una struttura rigida osservando i cambiamenti di frequenza e viscoelasticità¹⁰. Negli ultimi anni, il QCM ha inoltre offerto una solida piattaforma per monitorare la somministrazione di farmaci tramite vescicoli o nanoparticelle¹¹. All’intersezione tra ingegneria dei materiali e biologia molecolare e cellulare, possiamo usare il QCM per chiarire le interazioni chiave tra materiali e componenti bioattivi come proteine, acidi nucleici, liposomi e cellule. Ad esempio, l’adsortionte delle proteine a un biomateriale media le risposte cellulari a valle come l’infiammazione ed è spesso usato come indicatore positivo di biocompatibilità, mentre in altri casi l’attaccamento extracellulare delle proteine ai rivestimenti che si interfacciano con il sangue potrebbe indurre la coagulazione pericolosa nei vasi^12,13. Il QCM può quindi essere utilizzato come strumento per selezionare i candidati ottimali per esigenze diverse.

Due approcci comuni per l’esecuzione di esperimenti QCM raccolgono dati analoghi dall’esperimento: il primo approccio registra lo spostamento di frequenza e la metà della larghezza di banda ()del picco di conduttanza. Il secondo approccio, QCM con dissipazione (QCM-D), registra lo spostamento di frequenza e il fattore di dissipazione, che è direttamente proporzionale alla

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dove D è il fattore di dissipazione e è la frequenza. Sia D che – sono legati all’effetto di smorzamento che la pellicola ha sul sensore, che fornisce un’indicazione della rigidità della pellicola. Il pedice n denota la variazione di frequenza o armonica, che sono le frequenze di risonanza dispari del sensore al quarzo (n : 1, 3, 5, 7…). Ulteriori discussioni su modelli che utilizzano molteplici armoniche per ottenere le proprietà di massa e viscoelastica di un film possono essere trovate in una recensione di Johannsmann¹⁴ e documenti precedenti del gruppo Shull^15,16,17,18.

Una considerazione fondamentale per la preparazione dei campioni QCM è come applicare la pellicola sottile sulla superficie del sensore. Alcuni metodi comuni includono il rivestimento a spin, il rivestimento a tuffo, il rivestimento a goccia o l’adsorption del film sulla superficie del sensore durante l’esperimento^19,20. Ci sono quattro regioni per i campioni QCM: il limite di Sauerbrey, il regime viscoelastico, il regime di massa e il regime sovrasmordito. Per i film sufficientemente sottili, si applica il limite di Sauerbrey, dove lo spostamento di frequenzaèquello di una maggiore frequenza. Entro il limite di Sauerbrey, lo spostamento di frequenza si adatta linearmente con l’armonica risonante, n, e le variazioni nel fattore di smorzamento (D o z) sono generalmente piccole. In questo regime non sono disponibili informazioni sufficienti per determinare in modo univoco le proprietà reologiche del layer senza fare ipotesi aggiuntive. I dati di questo regime vengono utilizzati per calcolare la densità di massa della superficie (o spessore se la densità è nota a priori) della pellicola. Nel regime di massa in cui il mezzo a contatto con il cristallo è sufficientemente spesso, l’onda di taglio evanescente si propaga nel mezzo prima di essere completamente smorzata. Qui, nessuna informazione di massa può essere ottenuta utilizzando . Tuttavia, in questa regione, le proprietà viscoelastice sono determinate in modo affidabile utilizzando la combinazione di z –e ¹⁵ , ¹⁸. Nel regime di massa, se il mezzo è troppo rigido, il film smorza la risonanza del sensore, impedendo la raccolta di dati affidabili dal QCM. Il regime viscoelastico è il regime intermedio in cui la pellicola è abbastanza sottile da avere l’onda di taglio completamente propagata attraverso la pellicola e hanno valori affidabili per il fattore di smorzamento. Il fattore di smorzamento e il fattore di smorzamento e lasbarramento possono quindi essere usati per determinare le proprietà viscoelastiche del film e la sua massa. Qui, le proprietà viscoelastiche sono date dal prodotto della densità e della grandezza del complesso modulo di taglio . G p e l’angolo di fase dato da : arctan(G / G’). Quando i film sono preparati al limite di Sauerbrey, la massa per unità di superficie può essere calcolata direttamente in base all’equazione di Sauerbrey mostrata sotto²¹,

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dove n_è il cambiamento nella frequenza di risonanza, n è il tono di interesse,_è la frequenza risonante del sensore, zm / A è la massa per area del film, e q è l’impedimento acustico del quarzo, che per il quarzo tagliato AT è :_q , 8,84 x 10 6 kg / m² s. Il regime viscoelastico è più appropriato per lo studio delle pellicole polimeriche, e il limite di massa è utile per studiare polimeri viscosi²² o soluzioni proteiche¹⁶. I diversi regimi dipendono dalle proprietà del materiale di interesse, con lo spessore ottimale per la piena caratterizzazione viscoelastica e di massa generalmente aumentando con la rigidità della pellicola. La figura 1 descrive le quattro regioni per quanto riguarda la densità areale della pellicola, il modulo di taglio complesso e l’angolo di fase, in cui abbiamo assunto una relazione specifica tra l’angolo di fase e la rigidità della pellicola che è stata dimostrata rilevante per i materiali di questo tipo. Molti film di interesse pratico sono troppo spessi per studiare le proprietà viscoelastiche con QCM, come alcuni biofilm, dove gli spessori sono dell’ordine di decine a centinaia di micron²³. Tali pellicole spesse non sono generalmente adatte per lo studio utilizzando il QCM, ma possono essere misurate utilizzando risonatori a frequenza molto più bassi (come i risonatori torsionali)²³, permettendo all’onda di taglio di propagarsi ulteriormente nella pellicola.

Per determinare quale regime è rilevante per un dato campione QCM, è importante comprendere il parametro d /_n, che è il rapporto tra lo spessore della pellicola (d) e la lunghezza d’onda di taglio dell’oscillazione meccanica del sensore di cristallo di quarzo_(n)^15,16,18. Il regime viscoelastico ideale è d /_n – 0,05 – 0,2¹⁸, dove valori inferiori a 0,05 sono all’interno del limite di Sauerbrey e valori superiori a 0,2 si avvicinano al regime di massa. Una descrizione più rigorosa di d /_n è fornita altrove^15,18, ma è un parametro quantitativo che delinea il limite di Sauerbrey e il limite viscoelastico. I programmi di analisi utilizzati di seguito forniscono direttamente questo parametro.

Ci sono alcune limitazioni aggiuntive per l’analisi di pellicole sottili con il QCM. I calcoli Sauerbrey e viscoelastico presumono che la pellicola sia omogenea sia per lo spessore della pellicola che lateralmente sulla superficie dell’elettrodo del QCM. Mentre questa ipotesi rende difficile studiare i film che hanno vuoti o riempitivi presenti, ci sono state alcune indagini QCM su film costituiti da nanoparticelle innestate⁶. Se le eterogeneità sono piccole rispetto allo spessore complessivo della pellicola, è ancora possibile ottenere proprietà viscoelastiche affidabili del sistema composito. Per sistemi più eterogenei, i valori ottenuti da un’analisi viscoelastica devono sempre essere visti con grande cautela. Idealmente, i risultati ottenuti da sistemi con eterogeneità sconosciuta dovrebbero essere convalidati rispetto a sistemi che sono noti per essere omogenei. Questo è l’approccio che abbiamo adottato nel sistema di esempio descritto in questo documento.

Un punto importante che illustriamo in questo documento è l’esatta corrispondenza tra le misurazioni QCM effettuate nel dominio della frequenza (dove viene riportato il dominio di z) e gli esperimenti sul dominio temporale (dove viene riportato D). Vengono descritti i risultati di due diversi esperimenti QCM, un dominio temporale e un dominio di frequenza, ognuno dei quali coinvolge un sistema di modelli diverso ma concettualmente correlato. Il primo sistema è un semplice esempio di attaccamento del collagene al sensore per illustrare la cinetica di legame rappresentativa e l’equilibratura dell’adsorto nel tempo durante una misurazione del dominio temporale (QCM-D). Il collagene è la proteina più abbondante nel corpo, nota per la sua versatilità di comportamenti vincolanti e morfologia. La soluzione di collagene qui utilizzata non richiede un’ulteriore funzionalizzazione della superficie dorata del sensore per indurre l’adsorto⁹. Il secondo sistema sperimentale è un complesso di polielettroliti (PEC) composto da solfato di polistirolo anionico (PSS) e policazionale cationico (diallyldimethylammonium) (PDADMA) preparato allo stesso modo di Sadman et al.²². Questi materiali si gonfiano e diventano morbidi nelle soluzioni di sale (KBr in questo caso), offrendo una semplice piattaforma per studiare la meccanica dei polimeri utilizzando un approccio di dominio di frequenza (QCM-z). Per ogni protocollo, il processo di preparazione, assunzione e analisi di una misurazione è illustrato nella Figura 2. Lo schema mostra che la differenza principale tra gli approcci QCM- e QCM-D è nella fase di raccolta dei dati e la strumentazione utilizzata nell’esperimento. Tutte le tecniche di preparazione dei campioni menzionate sono compatibili con entrambi gli approcci e ogni approccio può analizzare gli esempi nelle tre aree illustrate nella Figura 1.

I nostri dati dimostrano che la preparazione di campioni, sia mediante rivestimento del sensore prima o durante una misurazione, determina la capacità di estrarre le proprietà viscoelastiche di un sistema. Progettando le prime fasi di un esperimento in modo appropriato, possiamo determinare quali informazioni possiamo raccogliere con precisione durante la fase di analisi.

Protocol

Annuncio collagene QCM-D 1. Preparazione del campione e pre-pulizia del sensore Preparare 20 mL di buffer in acetato da 0,1 M, regolando il pH con HCl e NaOH in base alle esigenze per ottenere il pH 5,6. Aggiungere la soluzione di collagene coda di ratto al buffer di 20 mL di acetato in condizioni sterili ad una concentrazione finale di 10 g/mL. Pulire il sensore al quarzo rivestito in oro per rimuovere materiale organico e biologico<sup class="xr…

Representative Results

I cambiamenti di frequenza con il tempo durante l’adsorbizione proteica presentano una curva caratteristica e plateau mostrato Figura 3A-B. Il lavaggio iniziale del buffer di 1x PBS sulla superficie del sensore nudo induce solo cambiamenti di frequenza trascurabili, offrendo una linea di base costante che funga da riferimento per i punti dati futuri. L’introduzione della soluzione di collagene provoca l’adsorbimento delle proteine, osservato come una costante diminuzione del…

Discussion

I risultati di adsorbimenti collagene coprono i regimi di Sauerbrey e viscoelastica. Tracciando gli spostamenti di frequenza normalizzati al numero armonico corrispondente, osserviamo che il limite di Sauerbrey è valido per circa le prime 2 h della misurazione. Con l’aderente crescente di massa al sensore, tuttavia, i cambi di frequenza normalizzati per la terza e la quinta armonica iniziano a deviare l’una dall’altra(t > 2 h), indicando una capacità di determinare le proprietà viscoelastiche della pellicola …

Materials

Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283	For collagen adsorption
Ammonium hydroxide solution	Sigma-Aldrich	221228	For collagen adsorption
Aqueous QCM probe	AWSensors	CLS 00050 A	For polyelectrolyte swelling
Collagen I Rat Protein, Tail	Thermo Fisher Scientific	A1048301	For collagen adsorption
Distilled water	Sigma-Aldrich	EM3234	For polyelectrolyte swelling; generally easy to acquire in research labs, but there is a catalog number in case it is not accessible
Ethanol	Sigma-Aldrich	793175-1GA-PB	For polyelectrolyte swelling
Gibco Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific	20012-027	For collagen adsorption
Hellmanex III	Sigma-Aldrich	Z805939	For collagen adsorption
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	216763	For collagen adsorption
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fisher Scientific	06-666A	For polyelectrolyte swelling
NP2K VNA	Makarov Instruments		For polyelectrolyte swelling
Poly(diallyldimethylammonium chloride), MW 200,000	Sigma-Aldrich	409022	For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al.
Poly(styrene-sulfonate) sodium salt 30% weight in water	Sigma-Aldrich	561967-500G	For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al.
Potassium Bromide	Sigma-Aldrich	793604-1KG	For polyelectrolyte swelling
QSense QCM Explorer System	Biolin Scientific		For collagen adsorption
Sodium acetate, anhydrous	Sigma-Aldrich	S2889	For collagen adsorption
Spin coater, Model WS-650MZ-23NPP	Laurell technologies		For polyelectrolyte swelling