Подготовка образцов в кварцевом кристалле Измерение микробаланса белковой адсорбции и полимерной механики

Summary

Микробаланс кварцевого кристалла может обеспечить точные свойства массы и вязкости для пленок в микрон или субмикроне, что актуально для исследований в области биомедицинского и экологического зондирования, покрытий и полимерной науки. Толщина образца влияет на информацию, которую можно получить из материала при контакте с датчиком.

Abstract

В этом исследовании мы представляем различные примеры того, как тонкая пленка подготовки к экспериментам микробаланса кварцевого кристалла информирует о соответствующем моделировании данных и определяет, какие свойства пленки можно количественно оценивать. Микробаланс кварцевого кристалла предлагает уникально чувствительную платформу для измерения тонких изменений массы и/или механических свойств прикладной пленки, наблюдая изменения в механическом резонансе кристалла кварца, колеблющихся на высокой частоте. Преимущества этого подхода включают его экспериментальную универсальность, способность изучать изменения свойств в широком диапазоне экспериментальных временных длин и использование небольших размеров выборки. Мы демонстрируем, что, основываясь на толщине и модуле сдвига слоя, отложенном на датчике, мы можем получить различную информацию из материала. Здесь эта концепция специально используется для отображения экспериментальных параметров, приводящих к массе и вязким вычислениям адсорбированного коллагена на золотых и полиэлектролитных комплексах во время отеков в зависимости от концентрации соли.

Introduction

Микробаланс кварцевого кристалла (ККМ) использует пьезоэлектрический эффект кварцевого кристалла для мониторинга его резонансной частоты, которая зависит от массы, прилипшой к поверхности. Техника сравнивает резонансную частоту и пропускную способность датчика кристалла кварца AT cut (обычно в диапазоне 5 МГц)¹ в воздухе или жидкости с частотой и пропускной способностью датчика после осаждения пленки. Есть несколько преимуществ для использования ЦКМ для изучения тонкой пленки свойства и интерфейсы, в том числе высокая чувствительность к массе и, возможно, вязкоупругой изменения свойства (в зависимости от единообразия образца и толщины), способность выполнять исследования на situ², и способность зондировать гораздо короче реологической шкале времени, чем традиционные сдвига реологии или динамического механического анализа (DMA). Прощупывание короткой реологической шкалы времени позволяет наблюдать, как реакция в этом временном масштабе меняется как в течение чрезвычайно коротких (мс)³ и длинных (лет) продолжительностей^4. Эта возможность полезна для изучения различных кинетических процессов, а также является полезным продолжением традиционных реометрических методов^5,6.

Высокая чувствительность ККМ также привела к его интенсивному использованию в биологических приложениях, изучающих фундаментальные взаимодействия крайне малых биомолекул. Поверхность датчика без покрытия или функционализированного датчика может быть использована для исследования адсорбции белка; более далее, биозондирование через сложные события связывания между ферментами, антителами и аптамерсами могут быть исследованы на основе изменений в массе^7,8,9. Например, метод был использован, чтобы понять преобразование пузырьков в планарный липидный двухслойный как двухэтапный процесс адсорбции жидкостных пузырьков к жесткой структуре, наблюдая коррелирующие изменения в частоте и вязкости^10. В последние годы, ККМ дополнительно предложил надежную платформу для мониторинга доставки наркотиков пузырьков или наночастиц¹¹. На стыке материаловедения и молекулярной и клеточной биологии, мы можем использовать ККМ для выяснения ключевых взаимодействий между материалами и биологически активными компонентами, такими как белки, нуклеиновые кислоты, липосомы и клетки. Например, экстрассирование белка к биоматериалу опосредует вниз по течению клеточных реакций, таких как воспаление и часто используется в качестве положительного индикатора биосовместимости, в то время как в других случаях внеклеточного белка вложения к покрытиям, что интерфейс с кровью может вызвать опасные свертывания в сосудах^12,13. Таким образом, ККМ может быть использован в качестве инструмента для выбора оптимальных кандидатов для различных нужд.

Два общих подхода к выполнению экспериментов «CM» собирают аналогичные данные эксперимента: первый подход записывает сдвиг частоты и половину пропускной способности (q) пика проводимости. Второй подход, ККМ с рассеиванием (КМ-Д), фиксирует сдвиг частоты и фактор рассеивания, который прямо пропорционален q через уравнение 1,¹⁴

(1)

где D является фактором рассеивания и – частотой. И D, и Q связаны с эффектом демпфирования пленки на датчик, который дает указание на жесткость пленки. В скрипте n обозначается частотный обертон или гармонический, которые являются нечетными резонансными частотами кварцевого датчика (n No 1, 3, 5, 7…). Дальнейшее обсуждение моделей с использованием нескольких гармоник для получения массы и вязкоусмотритенных свойств пленки можно найти в обзоре Johannsmann¹⁴ и предыдущие документы из группы Shull^15,16,17,18.

Одним из ключевых соображений для подготовки образцов ККМ является то, как применить тонкую пленку на поверхности датчика. Некоторые распространенные методы включают спин покрытие, падение покрытия, падение покрытия, или адсорбции пленки на поверхность датчика во время эксперимента^19,20. Для образцов ККМ есть четыре региона: предел ЗСМ, вязкая, режим массового отрезка и перегруженный режим. Для достаточно тонких пленок применяется ограничение Sauerbrey, где сдвиг частоты(яп.) обеспечивает плотность поверхностной массы пленки. В пределах предела Sauerbrey, шкалы сдвига частоты линейно с резонансным гармоническим, n, и изменения в факторе демпфирования (D или q) вообще малы. В этом режиме нет достаточной информации для однозначного определения реологических свойств слоя без дополнительных предположений. Данные в этом режиме используются для расчета плотности массы поверхности (или толщины, если плотность известна априори)пленки. В режиме навалом, где среда в контакте с кристаллом достаточно толстая, эвакуационная волна сдвига распространяется в среду, прежде чем полностью смоченной. В данном году никакой массовой информации не может быть получена с помощью q. Тем не менее, в этом регионе, вязкоэлаусные свойства надежно определяются с помощью комбинациииз ^15,18. В режиме навалом, если среда слишком жесткая, пленка будет влажным из резонанса датчика, предотвращая сбор каких-либо достоверных данных из ККМ. Визогусть режима является промежуточным режимом, где пленка достаточно тонкая, чтобы сдвига волна полностью распространяться через пленку, а также иметь надежные значения для демпфирующего фактора. Затем демпфирующий фактор и qмогут быть использованы для определения вязкоэластовых свойств пленки, а также ее массы. Здесь вязкоуэлная свойства дается продуктом плотности и величины сложного модуля сдвига Г. р и угол фазы, данный арктаном(G” / G’). Когда пленки подготовлены в пределе Sauerbrey, масса в зоне блока можно сразу вычислить на основе уравнения Sauerbrey показанного под^21,

(2)

где q_n является изменение резонансной частоты, n является подтекстом интереса,₁ является резонансной частотой датчика, м/ А является массой на область пленки, и _q является акустическим импедансом кварца, который для AT сократить кварц составляет 8,84 х ¹⁰кг / м²с. Визогусть режима наиболее подходит для изучения полимерных пленок, а предел навалом полезен для изучения вязких полимерных²² или белковых растворов^16. Различные режимы зависят от свойств материала, представляющих интерес, с оптимальной толщиной для полной вязкости и массовой характеристики обычно увеличивается с жесткостью пленки. На рисунке 1 описаны четыре региона в отношении плотности пленки, сложных модуля сдвига и угла фазы, где мы взяли на себя определенную связь между углом фазы и жесткостью пленки, которая, как было показано, имеет отношение к материалам этого типа. Многие пленки, представляющие практический интерес, слишком толстые для изучения вязких свойств с ККМ, таких как некоторые биопленки, где толщины находятся на порядок от десятков до сотен микрон²³. Такие толстые пленки, как правило, не подходят для изучения с помощью ККМ, но могут быть измерены с помощью гораздо более низкой частоты резонансов (таких, как торсионные резонансы)²³, что позволяет сдвига волна распространяться дальше в фильм.

Чтобы определить, какой режим имеет отношение к данной выборке , важно понимать_{параметр} d / n, который представляет собой отношение толщины пленки(d) к длине волны сдвига механического колебания кристаллического датчика кварца_{(No n})^15,16,18. Идеальный вязкивый режим d /_{n n} 0.05 – 0.2¹⁸, где значения ниже 0.05 находятся в пределах предела Sauerbrey и значения выше 0.2 приближаются к режиму навалом. Более строгое описание d /_n предоставляется в другом месте^15,18, но это количественный параметр, очерчивающих предел Sauerbrey и вязкоупругой предел. Программы анализа, используемые ниже, обеспечивают этот параметр напрямую.

Есть некоторые дополнительные ограничения для анализа тонких пленок с ККМ. Расчеты Sauerbrey и вязкости предполагают, что пленка однородна как по всей толщине пленки, так и боковой по всей поверхности электрода ККМ. Хотя это предположение делает его сложным для изучения фильмов, которые имеют пустоты или наполнители настоящее время, там были некоторые исследования ККМ в пленки, состоящие из привитых наночастиц⁶. Если неоднородности невелики по сравнению с общей толщиной пленки, надежные вязкоэласные свойства композитной системы все еще могут быть получены. Для более неоднородных систем значения, полученные в результате вискоупругового анализа, всегда следует рассматривать с большой осторожностью. В идеале результаты, полученные от систем с неизвестной неоднородностью, должны быть проверены против систем, которые, как известно, однородны. Таков подход, который мы взяли в примере системы, описанной в настоящем документе.

Важным моментом, который мы иллюстрируем в настоящем документе, является точное соответствие между измерениями, выполненными в области частоты (где сообщается о Х) и экспериментами домена времени (где сообщается D). Описаны результаты двух различных экспериментов, один тайм и один домен частоты, каждый из которых связан с другой, но концептуально связанной модельной системой. Первая система является простым примером прикрепления коллагена к датчику, чтобы проиллюстрировать репрезентативной связывающей кинетики и уравновешчастия адсорбции с течением времени во время измерения домена времени . Коллаген является наиболее распространенным белком в организме, известный своей универсальностью связывающего поведения и морфологии. Коллагенный раствор, используемый здесь, не требует дополнительной функционализации золотой поверхности датчика, чтобы вызвать адсорбцию^9. Вторая экспериментальная система представляет собой полиэлектролитный комплекс (ПЭК), состоящий из анионического полистирола сульфоната (PSS) и катионного поли (diallyldimethylammonium) (PDADMA), подготовленного таким же образом, как Sadman et al.²². Эти материалы набухают и становятся мягкими в соли (KBr в данном случае) решений, предлагая простую платформу для изучения полимерной механики с использованием подхода домена частоты (КМЗ-З). Для каждого протокола процесс подготовки, взятия и анализа измерения показан на рисунке 2. Схема показывает, что основное различие между подходами «CM-» и «CM-D» заключается в этапе сбора данных и приборах, используемых в эксперименте. Все упомянутые методы подготовки выборки совместимы с обоими подходами, и каждый подход может анализировать образцы в трех регионах, изображенных на рисунке 1.

Наши данные показывают, что подготовка образцов, будь то сенсорное покрытие до или во время измерения, диктует способность извлекать вязкоэласные свойства системы. Правильно спроектируя ранние этапы эксперимента, мы можем определить, какую информацию мы можем точно собрать на этапе анализа.

Protocol

Адсорпция коллагена «CM-D» 1. Подготовка образца и предварительная очистка датчиков Приготовьте 20 мл ацетатного буфера 0,1 М, регулируя рН с HCl и NaOH по мере необходимости для достижения рН 5,6. Добавьте раствор коллагена хвоста крысы к 20 mL буфера ацетата под…

Representative Results

Изменения частоты со временем во время адсорбции белка демонстрируют характерную кривую и плато, показанную на рисунке 3A-B. Первоначальная буферная вымывание 1x PBS по поверхности голой сенсорной поверхности вызывает лишь незначительные изменения в частоте, пре…

Discussion

Результаты адсорбции коллагена охватывают режимы Sauerbrey и viscoelastic. Позамыв, что сдвиги частоты нормализуются до соответствующего гармонического числа, мы наблюдаем, что предел Sauerbrey соответствует примерно первым 2 ч измерения. С увеличением массы примыкания к датчику, однако, нормализов?…

Materials

Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283	For collagen adsorption
Ammonium hydroxide solution	Sigma-Aldrich	221228	For collagen adsorption
Aqueous QCM probe	AWSensors	CLS 00050 A	For polyelectrolyte swelling
Collagen I Rat Protein, Tail	Thermo Fisher Scientific	A1048301	For collagen adsorption
Distilled water	Sigma-Aldrich	EM3234	For polyelectrolyte swelling; generally easy to acquire in research labs, but there is a catalog number in case it is not accessible
Ethanol	Sigma-Aldrich	793175-1GA-PB	For polyelectrolyte swelling
Gibco Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific	20012-027	For collagen adsorption
Hellmanex III	Sigma-Aldrich	Z805939	For collagen adsorption
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	216763	For collagen adsorption
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fisher Scientific	06-666A	For polyelectrolyte swelling
NP2K VNA	Makarov Instruments		For polyelectrolyte swelling
Poly(diallyldimethylammonium chloride), MW 200,000	Sigma-Aldrich	409022	For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al.
Poly(styrene-sulfonate) sodium salt 30% weight in water	Sigma-Aldrich	561967-500G	For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al.
Potassium Bromide	Sigma-Aldrich	793604-1KG	For polyelectrolyte swelling
QSense QCM Explorer System	Biolin Scientific		For collagen adsorption
Sodium acetate, anhydrous	Sigma-Aldrich	S2889	For collagen adsorption
Spin coater, Model WS-650MZ-23NPP	Laurell technologies		For polyelectrolyte swelling