Preparación de muestras en Mediciones de microbalance de cristal de cuarzo de adsorción de proteínas y mecánica de polímeros

Summary

El microbalance de cristal de cuarzo puede proporcionar propiedades precisas de masa y viscoelástica para películas en el rango de micras o submicrones, lo que es relevante para investigaciones en detección biomédica y ambiental, recubrimientos y ciencia de polímeros. El espesor de la muestra influye en qué información se puede obtener del material en contacto con el sensor.

Abstract

En este estudio, presentamos varios ejemplos de cómo la preparación de película delgada para experimentos de microbalanza de cristal de cuarzo informa el modelado adecuado de los datos y determina qué propiedades de la película se pueden cuantificar. El microbalance de cristal de cuarzo ofrece una plataforma únicamente sensible para medir los cambios finos en las propiedades mecánicas y/o de masa de una película aplicada observando los cambios en la resonancia mecánica de un cristal de cuarzo que oscila a alta frecuencia. Las ventajas de este enfoque incluyen su versatilidad experimental, la capacidad de estudiar los cambios en las propiedades en una amplia gama de longitudes de tiempo experimentales y el uso de pequeños tamaños de muestra. Demostramos que, en base al espesor y el módulo de cizallamiento de la capa depositada en el sensor, podemos adquirir información diferente del material. Aquí, este concepto se explota específicamente para mostrar parámetros experimentales que resultan en cálculos de masa y viscoelástica de colágeno adsorbida en complejos de oro y polielectrolitos durante la hinchazón en función de la concentración de sal.

Introduction

El microbalance de cristal de cuarzo (QCM) aprovecha el efecto piezoeléctrico de un cristal de cuarzo para controlar su frecuencia resonante, que depende de la masa adherida a la superficie. La técnica compara la frecuencia resonante y el ancho de banda de un sensor de cristal de cuarzo cortado AT (normalmente en el rango de 5 MHz)¹ en aire o un fluido con la frecuencia y el ancho de banda del sensor después de la deposición de una película. Hay varios beneficios para el uso del QCM para estudiar las propiedades e interfaces de película delgada, incluyendo la alta sensibilidad a la masa y potencialmente a los cambios de propiedad viscoelástica (dependiendo de la uniformidad y el grosor de la muestra), la capacidad de realizar estudios en el lugar^2,y la capacidad de sondear una escala de tiempo reológica mucho más corta que la reología de cizallamiento tradicional o el análisis mecánico dinámico (DMA). Sondear una escala temporal reológica corta permite la observación de cómo la respuesta en este intervalo de tiempo cambia tanto en tiempos extremadamente cortos (ms)³ y largas (años) duraciones⁴. Esta capacidad es beneficiosa para el estudio de una variedad de procesos cinéticos y también es una extensión útil de las técnicas reométricas tradicionales^5,6.

La alta sensibilidad del QCM también ha llevado a su uso intensivo en aplicaciones biológicas que estudian las interacciones fundamentales de biomoléculas extremadamente pequeñas. Una superficie de sensor no recubierta o funcionalizada se puede utilizar para investigar la adsorción de proteínas; aún más, el bioensión a través de eventos de unión complejos entre enzimas, anticuerpos y aptámeros se puede examinar en función de los cambios en la masa^7,8,9. Por ejemplo, la técnica se ha utilizado para entender la transformación de las vesículas a una bicapa lipídica plana como un proceso bifásico bifásico de adsorción de vesículas que contienen líquidos a una estructura rígida observando cambios correlacionados en la frecuencia y la viscoelasticidad^10. En los últimos años, el QCM ha ofrecido además una plataforma robusta para monitorear la administración de fármacos por vesículas o nanopartículas¹¹. En la intersección de la ingeniería de materiales y la biología molecular y celular, podemos utilizar el QCM para dilucidar interacciones clave entre materiales y componentes bioactivos como proteínas, ácidos nucleicos, liposomas y células. Por ejemplo, la adsorción de proteínas a un biomaterial media respuestas celulares aguas abajo como la inflamación y a menudo se utiliza como un indicador positivo de biocompatibilidad, mientras que en otros casos la unión de proteína extracelular a recubrimientos que interactúan con la sangre podría inducir coagulación peligrosa en los vasos^12,13. Por lo tanto, el QCM se puede utilizar como una herramienta para seleccionar candidatos óptimos para diferentes necesidades.

Dos enfoques comunes para realizar experimentos qCM recopilan datos análogos del experimento: el primer enfoque registra el cambio de frecuencia y la mitad del ancho de banda() del pico de conductividad. El segundo enfoque, QCM con disipación (QCM-D), registra el cambio de frecuencia y el factor de disipación, que es directamente proporcional a la ecuación 1,¹⁴

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donde D es el factor de disipación y es la frecuencia. Tanto D como é están relacionados con el efecto de amortiguación que la película tiene en el sensor, lo que indica la rigidez de la película. El subíndice n denota el armónico o armónico de frecuencia, que son las frecuencias resonantes impares del sensor de cuarzo (n a 1, 3, 5, 7…). Más discusión de modelos utilizando múltiples armónicos para obtener la masa y las propiedades viscoelásticas de una película se puede encontrar en una revisión de Johannsmann¹⁴ y documentos anteriores del grupo Shull^15,16,17,18.

Una consideración clave para preparar muestras QCM es cómo aplicar la película delgada en la superficie del sensor. Algunos métodos comunes incluyen recubrimiento de espín, recubrimiento por inmersión, recubrimiento de gotas o adsorción de la película en la superficie del sensor durante el experimento^19,20. Hay cuatro regiones para las muestras qCM: el límite de Sauerbrey, el régimen viscoelástico, el régimen a granel y el régimen sobreamplificado. Para películas suficientemente delgadas, se aplica el límite de Sauerbrey, donde el cambio de frecuencia(o)proporciona la densidad de masa de la superficie de la película. Dentro del límite de Sauerbrey, las escalas de cambio de frecuencia linealmente con el armónico resonante, n, y los cambios en el factor de amortiguación (D o )son generalmente pequeños. En este régimen no se dispone de suficiente información para determinar de forma exclusiva las propiedades reológicas de la capa sin hacer suposiciones adicionales. Los datos de este régimen se utilizan para calcular la densidad de masa superficial (o el grosor si la densidad se conoce a priori)de la película. En el régimen a granel en el que el medio en contacto con el cristal es lo suficientemente grueso, la onda cortante evanescente se propaga en el medio antes de ser completamente amortiguada. Aquí, no se puede obtener ninguna información de masa utilizando. Sin embargo, en esta región, las propiedades de viscoelástica se determinan de forma fiable utilizando la combinación delos números ^15,18. En el régimen a granel, si el medio es demasiado rígido, la película amortiguará la resonancia del sensor, evitando la recopilación de datos fiables del QCM. El régimen viscoelástico es el régimen intermedio donde la película es lo suficientemente delgada como para que la onda cortante se propague completamente a través de la película, así como para tener valores fiables para el factor de amortiguación. A continuación, se puede utilizar el factor de amortiguación yel factor de amortiguación para determinar las propiedades viscoelásticas de la película, así como su masa. Aquí, las propiedades viscoelásticas son dadas por el producto de la densidad y la magnitud del módulo de cizallamiento complejo . G* p y el ángulo de fase dado por el valor de arctan(G” / G’). Cuando las películas se preparan en el límite de Sauerbrey, la masa por unidad de área se puede calcular directamente sobre la base de la ecuación de Sauerbrey que se muestra a continuación²¹,

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Donde el n es el cambio en la frecuencia resonante, n es el tono de interés, 1_es la frecuencia resonante del sensor,m / A es la masa por área de la película, y Z_q es la impedancia acústica del cuarzo, que para el cuarzo cortado AT es Z_q a 8,84 x 10⁶kg / m²s. El régimen viscoelástico es más adecuado para el estudio de películas poliméricas, y el límite a granel es útil para el estudio de polímero viscoso²² o soluciones proteicas^16. Los diferentes regímenes dependen de las propiedades del material de interés, con el espesor óptimo para la caracterización viscoelástica completa y de masa sin aumentar generalmente con la rigidez de la película. La Figura 1 describe las cuatro regiones con respecto a la densidad areal de la película, el módulo de cizallamiento complejo y el ángulo de fase, donde hemos asumido una relación específica entre el ángulo de fase y la rigidez de la película que se ha demostrado que es relevante para los materiales de este tipo. Muchas películas de interés práctico son demasiado gruesas para estudiar las propiedades viscoelásticas con QCM, como ciertas biopelículas, donde los espesores están en el orden de decenas a cientos de micras^23. Estas películas gruesas generalmente no son apropiadas para estudiar usando el QCM, pero pueden medirse usando resonadores de frecuencia mucho más baja (como resonadores torsionales)^23,permitiendo que la onda cortante se propague aún más en la película.

Para determinar qué régimen es relevante para una muestra QCM determinada, es importante entender el parámetro d /_n, que es la relación entre el espesor de la película (d) y la longitud de onda de cizallamiento de la oscilación mecánica del sensor de cristal de cuarzo_(n)^15,16,18. El régimen viscoelástico ideal es d /_n á 0,05 – 0,2¹⁸, donde los valores por debajo de 0,05 están dentro del límite de Sauerbrey y los valores por encima de 0,2 se acercan al régimen a granel. En otros lugares^seproporciona una descripción más rigurosa de d _/n, pero es un parámetro cuantitativo que desentraña el límite de Sauerbrey y el límite viscoelástico. Los programas de análisis utilizados a continuación proporcionan este parámetro directamente.

Hay algunas limitaciones adicionales para analizar películas delgadas con el QCM. Los cálculos Sauerbrey y viscoelástico suponen que la película es homogénea tanto en todo el espesor de la película como lateralmente a través de la superficie del electrodo del QCM. Si bien esta suposición hace difícil estudiar películas que tienen vacíos o rellenos presentes, ha habido algunas investigaciones de QCM sobre películas consistentes en nanopartículas injertadas⁶. Si las heterogeneidades son pequeñas en comparación con el espesor total de la película, todavía se pueden obtener propiedades viscoelásticas fiables del sistema compuesto. Para sistemas más heterogéneos, los valores obtenidos a partir de un análisis viscoelástico siempre deben ser vistos con mucha precaución. Idealmente, los resultados obtenidos de sistemas con heterogeneidad desconocida deben validarse contra sistemas que se sabe que son homogéneos. Este es el enfoque que hemos adoptado en el sistema de ejemplo descrito en este documento.

Un punto importante que ilustramos en este documento es la correspondencia exacta entre las mediciones de QCM realizadas en el dominio de frecuencia (donde se informa de la palabra ) y los experimentos de dominio de tiempo (donde se informa D). Se describen los resultados de dos experimentos QCM diferentes, un dominio de tiempo y un dominio de frecuencia, cada uno de los que implica un sistema de modelo diferente pero conceptualmente relacionado. El primer sistema es un ejemplo simple de fijación de colágeno al sensor para ilustrar la cinética de unión representativa y el equilibrio de adsorción a lo largo del tiempo durante una medición de dominio de tiempo (QCM-D). El colágeno es la proteína más abundante en el cuerpo, conocida por su versatilidad de comportamientos de unión y morfología. La solución de colágeno utilizada aquí no requiere funcionalización adicional de la superficie de oro del sensor para inducir la adsorción^9. El segundo sistema experimental es un complejo de polielectrolitos (PEC) compuesto por sulfonato de poliestireno aniónico (PSS) y policatiónico catiónico (diallyldimethylammonium) (PDADMA) preparado de la misma manera que Sadman et al.²². Estos materiales se hinchan y se vuelven suaves en soluciones de sal (KBr en este caso), ofreciendo una plataforma simple para el estudio de la mecánica de polímeros utilizando un enfoque de dominio de frecuencia (QCM-Z). Para cada protocolo, el proceso de preparación, toma y análisis de una medición se muestra en la Figura 2. El esquema muestra que la principal diferencia entre los enfoques QCM-Z y QCM-D está en el paso de recopilación de datos y la instrumentación utilizada en el experimento. Todas las técnicas de preparación de muestras mencionadas son compatibles con ambos enfoques, y cada enfoque puede analizar muestras en las tres regiones representadas en la Figura 1.

Nuestros datos demuestran que la preparación de muestras, ya sea mediante recubrimiento de sensor antes o durante una medición, dicta la capacidad de extraer las propiedades viscoelásticas de un sistema. Al diseñar las primeras etapas de un experimento adecuadamente, podemos determinar qué información podemos recopilar con precisión durante el paso de análisis.

Protocol

Adsorción de colágeno QCM-D 1. Preparación de muestras y prelimpieza del sensor Preparar 20 ml de tampón de acetato de 0,1 M, ajustando el pH con HCl y NaOH según sea necesario para lograr el pH a 5,6. Añadir la solución de colágeno de cola de rata a los 20 ml de tampón de acetato en condiciones estériles a una concentración final de 10 g/ml. Limpie el sensor de cuarzo recubierto de oro para eliminar el material orgánico y biológico<s…

Representative Results

Los cambios en la frecuencia con el tiempo durante la adsorción de proteínas muestran una curva y meseta característica que se muestran en la Figura 3A-B. El lavado tampón inicial de 1pbS a través de la superficie del sensor desnudo induce sólo cambios insignificantes en la frecuencia, ofreciendo una línea de base constante para actuar como referencia para los puntos de datos futuros. La introducción de la solución de colágeno hace que comience la adsorción de pro…

Discussion

Los resultados de la adsorción de colágeno abarcan los regímenes de Sauerbrey y viscoelástico. Al trazar los cambios de frecuencia normalizados al número armónico correspondiente, observamos que el límite de Sauerbrey se mantiene fiel para aproximadamente las primeras 2 h de la medición. Con el aumento de la masa de adcejo al sensor, sin embargo, los cambios de frecuencia normalizados para el tercer y quinto armónicos comienzan a desviarse unos de otros(t > 2 h), lo que indica una capacidad para determi…

Materials

Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283	For collagen adsorption
Ammonium hydroxide solution	Sigma-Aldrich	221228	For collagen adsorption
Aqueous QCM probe	AWSensors	CLS 00050 A	For polyelectrolyte swelling
Collagen I Rat Protein, Tail	Thermo Fisher Scientific	A1048301	For collagen adsorption
Distilled water	Sigma-Aldrich	EM3234	For polyelectrolyte swelling; generally easy to acquire in research labs, but there is a catalog number in case it is not accessible
Ethanol	Sigma-Aldrich	793175-1GA-PB	For polyelectrolyte swelling
Gibco Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific	20012-027	For collagen adsorption
Hellmanex III	Sigma-Aldrich	Z805939	For collagen adsorption
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	216763	For collagen adsorption
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fisher Scientific	06-666A	For polyelectrolyte swelling
NP2K VNA	Makarov Instruments		For polyelectrolyte swelling
Poly(diallyldimethylammonium chloride), MW 200,000	Sigma-Aldrich	409022	For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al.
Poly(styrene-sulfonate) sodium salt 30% weight in water	Sigma-Aldrich	561967-500G	For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al.
Potassium Bromide	Sigma-Aldrich	793604-1KG	For polyelectrolyte swelling
QSense QCM Explorer System	Biolin Scientific		For collagen adsorption
Sodium acetate, anhydrous	Sigma-Aldrich	S2889	For collagen adsorption
Spin coater, Model WS-650MZ-23NPP	Laurell technologies		For polyelectrolyte swelling