Generación de paisajes químicos controlados y dinámicos para estudiar el comportamiento microbiano

Summary

Se presenta un protocolo para la generación de paisajes químicos dinámicos por fotólisis dentro de configuraciones microfluídicas y milifluídicas. Esta metodología es adecuada para estudiar diversos procesos biológicos, incluyendo el comportamiento móvil, la acumulación de nutrientes o la adaptación a los productos químicos de los microorganismos, tanto a nivel de una sola célula como de población.

Abstract

Demostramos un método para la generación de pulsos químicos controlados y dinámicos, donde la quimioattractant localizada se vuelve repentinamente disponible a escala micropara crear microambientes para experimentos de quimiotaxis microbianos. Para crear pulsos químicos, desarrollamos un sistema para introducir fuentes de aminoácidos casi instantáneamente por fotólisis de aminoácidos enjaulados dentro de una cámara microfluida de polidimetilsiloxano (PDMS) que contiene una suspensión bacteriana. Aplicamos este método a la bacteria quimiotáctica, Vibrio ordalii,que puede escalar activamente estos degradados químicos dinámicos mientras se rastrea mediante microscopía de vídeo. Los aminoácidos, que se vuelven biológicamente inertes («enjaulados») por modificación química con un grupo protector fotoextraíble, están uniformemente presentes en la suspensión, pero no están disponibles para su consumo hasta su liberación repentina, que se produce en puntos definidos por el usuario en el tiempo y el espacio mediante un haz LED centrado cerca de los rayos UV-A. El número de moléculas liberadas en el pulso puede determinarse mediante una relación de calibración entre el tiempo de exposición y la fracción de desauno, donde el espectro de absorción después de la fotólisis se caracteriza por el uso de espectroscopia UV-Vis. Una membrana de policarbonato nanoporoso (PCTE) se puede integrar en el dispositivo microfluídico para permitir la eliminación continua por flujo de los compuestos no enjaulados y los medios gastados. Un enlace fuerte e irreversible entre la membrana PCTE y la estructura microfluídica PDMS se logra recubriendo la membrana con una solución de 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) seguida de la activación plasmática de las superficies a unir. Un sistema controlado por ordenador puede generar secuencias de pulsos definidas por el usuario en diferentes ubicaciones y con diferentes intensidades, con el fin de crear paisajes de recursos con variabilidad espacial y temporal prescrita. En cada paisaje químico, se puede obtener la dinámica del movimiento bacteriano a escala individual y su acumulación a nivel de población, permitiendo así la cuantificación del rendimiento quimiotáctico y sus efectos en las agregaciones bacterianas en entornos ecológicamente relevantes.

Introduction

Los microbios se basan en la quimiotaxis, el proceso de detección de gradientes químicos y la modificación de la motilidad en la respuesta^1,para navegar por paisajes químicos, acercarse a fuentes de nutrientes y huéspedes, y escapar de sustancias nocivas. Estos procesos a microescala determinan la cinética macroeconómica de las interacciones entre los microbios y su entorno^2,3. Los recientes avances en microfluídicas y tecnologías de microfabricación, incluida la litografía blanda^4,han revolucionado nuestra capacidad de crear microambientes controlados en los que estudiar las interacciones de los microbios. Por ejemplo, experimentos anteriores han estudiado la quimiotaxis bacteriana generando gradientes estables y altamente controlados de concentraciones de nutrientes intermedios a altos^5,6. Sin embargo, en entornos naturales, los gradientes químicos a microescala pueden ser disipados de corta duración por difusión molecular, y las condiciones de fondo son a menudo altamente diluidas⁷. Para medir directamente la respuesta quimiotáctica de las poblaciones microbianas expuestas por primera vez a entornos químicos inestables, hemos ideado y aquí describimos métodos para combinar la tecnología microfluídica con la fotólisis, imitando así los gradientes que las bacterias silvestres encuentran en la naturaleza.

La tecnología de uncaging emplea sondas sensibles a la luz que encapsulan funcionalmente las biomoléculas de forma inactiva. La irradiación libera la molécula enjaulada, permitiendo la perturbación dirigida de un proceso biológico⁸. Debido al control rápido y preciso de la química celular que el uncaging ofrece⁹, la fotólisis de los compuestos enjaulados ha sido empleada tradicionalmente por biólogos, fisiólogos y neurocientíficos para estudiar la activación de^{genes 10,}canales iónicos¹¹y neuronas^12. Más recientemente, los científicos han aprovechado las ventajas significativas de la fotólisis para estudiar la quimiotaxis^13,para determinar la dinámica de conmutación de flagelos de células bacterianas individuales expuestas a un estímulo quimioatraer escalono^14,15, e investigar patrones de motilidad de espermatozoides individuales en gradientes tridimensionales (3D)¹⁶.

En nuestro enfoque, implementamos la fotólisis de aminoácidos enjaulados dentro de dispositivos microfluídicos para estudiar la respuesta conductual de una población bacteriana a pulsos químicos controlados, que se vuelven casi instantáneamente disponibles a través de la fotoliberación. El uso de un objetivo de bajo aumento (4x) (NA a 0,13, profundidad de enfoque de aproximadamente 40 m) permite tanto la observación de la respuesta agregativa a nivel de población de miles de bacterias en un gran campo de visión (3,2 mm x 3,2 mm), como la medición del movimiento a nivel de una sola célula. Presentamos dos aplicaciones de este método: 1) la liberación de un solo pulso químico para estudiar la dinámica de acumulación bacteriana de disipación a partir de condiciones uniformes, y 2i) la liberación de múltiples pulsos para caracterizar la dinámica de acumulación bacteriana en condiciones de quimioatractorancias espacialmente heterogéneas que varían en el tiempo. Este método ha sido probado en las bacterias marinas Vibrio ordalii realizando quimiotaxis hacia el aminoácido glutamato¹⁷, pero el método es ampliamente aplicable a diferentes combinaciones de especies y quimioatractores, así como a procesos biológicos más allá de la quimiotaxis (por ejemplo, la aceptación de nutrientes, la exposición a antibióticos, la detección de quórum). Este enfoque promete ayudar a dilucidar la ecología y el comportamiento de los microorganismos en ambientes realistas y descubrir las compensaciones ocultas que enfrentan las bacterias individuales al navegar por gradientes dinámicos efímeros.

Protocol

1. Fabricación del dispositivo microfluídico para el experimento de pulso químico único Diseñe el canal utilizando el software de diseño asistido por ordenador (CAD) e imprímalo en una película de transparencia para crear la máscara de foto(Figura 1A). Fabricar al maestro por litografía suave (en condiciones de sala limpia). Limpie una oblea de silicio (4 pulgadas) en rápida sucesión con acetona, metanol e isopropanol, luego seque con …

Representative Results

Utilizamos los dispositivos microfluídicos y milifluidos(Figura 1)para estudiar perfiles de acumulación bacteriana en condiciones de nutrientes dinámicos. Las trayectorias bacterianas se extrajeron de los videos grabados adquiridos por microscopía de contraste de fase de la dinámica de acumulación-disipación de una población bacteriana después de un pulso químico liberado por la fotólisis(Figura 2 y Figura 3). Al promedia…

Discussion

Este método permite a los investigadores estudiar la quimiotaxis bacteriana bajo gradientes dinámicos controlados en dispositivos micro y milifluidos, lo que permite la adquisición de datos reproducibles. La creación casi instantánea de pulsos químicos a microescala por fotólisis tiene como objetivo reproducir los tipos de pulsos de nutrientes que las bacterias encuentran en la naturaleza a partir de una gama de fuentes, por ejemplo, la difusión difusa de plumas detrás del hundimiento de partículas marinas<sup …

Materials

(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES)	Sigma-Aldrich	A3648	>98% purity, highly toxic
CELLSTAR tube	Greiner Bio-One	210261	50 ml
Centrifuge	Eppendorf	5424R	to eliminate spent media from the bacterial culture
Digital Incubators Incu-Line	VWR-CH	390-0384	to bake 3D master
Duster	VWR-CH	16650-22	to clean the wafer and microchannels
Hot plate	VWR-CH	444-0601	to bond the microchannels
Isopropanol	Sigma-Aldrich	W292907
LightSafe micro centrifuge tubes	Sigma-Aldrich	Z688312	1.5 ml
MATLAB	Mathworks		for image analysis and bacterial tracking
Microcentrifuge tube	Eppendorf	30120086	1.5 ml
Microscope glass slide	VWR-CH	631-1552
Microscope Nikon Eclipse TiE	Nikon Instruments	MEA53100	with motorized stage
MNI-Glutamate	Tocris Bioscience	1490	>98 % purity, photosensitive
Mold printing equipment	Stratasys		Objet30 3D printer
Mold printing service	3D Printing Studios	Custom	https://www.3dprintingstudios.com/
Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	to calibrate the uncaging
NIS Elements	Nikon Instruments		Microscope Imaging Software
Oven Venti-Line	VWR-CH	466-3516	to bake PDMS (with forced convection)
Photoresist SU-8-3050	MicroChem Corp.	SU8-3050
Plasma chamber Zepto	Diener Electronic	ZEPTO-1	to functionalize the surfaces before bonding
Polycarbonate membrane	Sterlitech	PCT0447100	0.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness
Polyethylene microtubing	Scientific Commodities	BB31695-PE/2	I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm
Polystyrene Petri dish	VWR-CH	25373-100	bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device
Scale	VWR-CH	611-2605	to weight PDMS mixture
sCMOS camera Andor Zyla	Oxford Instruments		for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps)
Sea salt	Instant Ocean	Product No. SS1-160p
SolidWorks 2015	Dassault Systemes SolidWorks		Used to design the mold
Spectra X light engine	Lumencolor		for LED 395 nm
Sylgard 184	Dow Corning	110-41-155	PDMS Si Elastomer Kit; curing agent
Syringe (Luer-Lok)	B Braun Omnifix	4616308F
Syringe Needle	Agani	A228	from 10 to 30 ml
Syringe Pump 11 Pico Plus Elite	Harvard Apparatus	70-4506	Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm)
VeroGrey	Stratasys		Dual Syringe Pump
Vortex-Genie	Scientific Industries	SI-0236	Mold Material