风险蝴蝶捕获繁殖计划，以提高生命历史知识和有效的异地保护技术

Summary

在这里，我们提出协议1）联邦濒危迈阿密蓝蝴蝶（Cyclargus托马斯·本特恩巴基）的实验室圈养繁殖，以及2）评估基本生命历史信息，如不成熟的发展时间和幼虫幼虫数量。这两种方法都可以调整用于其他原位保护计划。

Abstract

提高对风险蝴蝶的异地最佳做法的了解对于产生成功的保护和恢复方案成果非常重要。研究这些圈养种群还可以产生有价值的数据，以解决有关目标分类的行为、生命历史和生态的关键信息差距。我们描述了一个协议，为联邦濒危的Cyclargus托马斯托马斯贝图恩巴基，可以用作模型，为其他风险蝴蝶原位程序，特别是那些在家庭Lycaenidae。我们进一步提供了一个简单和直接的协议，记录各种生命历史指标，可用于通知原位方法，以及适应实验室研究的其他白鳍豚。

Introduction

越来越多的研究表明，全球蝴蝶数量普遍和严重下降^{，蝴蝶数量为1，2，3，4，5。}这包括绝大多数处于危险中的物种。旨在减少这种下降的保护计划通常采用多种战略，包括种群监测、生境管理和恢复、科学研究、圈养繁殖和生物体易位^6。仅在美国及其领土内，《濒危物种法》（ESA）就将总共30只蝴蝶列为濒危物种或濒危物种，其中21种已批准恢复计划草案或最终恢复计划。对于这种分类，超过一半的已识别的恢复策略建议圈养繁殖或状态，应评估圈养传播⁷。^近年来，对蝴蝶的异地保护工作有了相当大的^{增长，并有可能}成为帮助^{恢复工作的重要}工具。许多机构、组织和机构目前正在参与至少11个欧空局列入的蝴蝶分类（即，赛克莱古斯·托马斯·贝图恩巴基、尤菲德里亚斯·迪达·奎诺、 尤菲德里亚·塔伊达·塔莱伊、赫拉克利德斯·阿里斯托德梅、哈斯佩里亚·达科泰、莱凯伊德斯·梅利萨·萨缪里斯、奥里斯马·波韦希克、皮尔古斯·农村拉古纳和斯佩里亚·泽雷内·希马莱塔）和其他几个处于危险中的分类（例如，卡洛尔菲斯·伊鲁斯欧马乌斯·阿塔拉¹¹.尽管作出了许多有力和成功的努力，但方案之间以及保护从业人员之间仍然缺乏定期沟通，涉及思想、数据、有效方法和成果的交流。这种知识共享至关重要，因为它有助于尽量减少工作重复，改进总体最佳做法，并增强保护影响。很少有出版的头启动，圈养饲养，繁殖，或饲养协议是现成的风险蝴蝶分类，和那些往往缺乏足够的叙述细节和/或插图。这些通常提供大多数摘要细节与有限的分步说明和附带的图像，使复制具有挑战性的或应用程序到其他分类难以评估12，13，14，15。许多可用的协议在某种程度上是有限的：它们只存在于灰色文献中，或存在于不同的详细程度、出版年龄，或作为研讨会程序、机构/编写者报告或内部手册16、17、18、19、20、21、22、23、24的组成部分。

对于大多数保护计划，圈养繁殖主要是为了支持保护迁移，包括重新引入、强化（即增强）和介绍^25、26。这些活动旨在战略性地实施，作为整体恢复战略的一个组成部分，以帮助防止所列物种、亚种或种群灭绝。然而，应当指出，这是此类异地程序可能发挥的其他几个潜在角色之一。这些措施还可包括维持保险（即，反之）人口、临时生物救援、支持与恢复有关的研究和/或培训，以及促进与保护有关的教育和提高认识工作^27、28。无论异地计划是具有单一确定的目标，还是多个目标的组合，保护从业人员都应最大限度地利用数据收集的机会，以便尽可能填补关键信息空白。这一点尤其重要，因为绝大多数处于风险中的分类在野生种群大量减少之前，一般研究得很差。由此产生的有关焦点分类的各种行为、生态或生命历史方面的强化知识，有助于促进有效的物种保护和管理^29。

在这里，我们详细介绍了为联邦濒危的迈阿密蓝蝴蝶（Cyclargus thomasi Bethunebakeri）开发的圈养繁殖协议（补充图1），作为大型保护和恢复计划的一部分。在这种情况下，圈养繁殖计划具有三个具体确定的作用：1） 现有野生种群消失时的保险种群;2） 旨在填补已确定的生态和生命历史知识空白的研究种群，这些知识可能有助于恢复和/或管理;3） 生产可行的生物，用于在分类的历史范围内进行保护。由此产生的协议经过充分审查和验证，已经使用和改进了十多年。因此，我们认为，所述技术和方法代表了一种可行的模型，可以应用于或随时适用于其他有危险的异地蝴蝶方案，特别是那些涉及Lycaenidae或相关分类的方案。虽然我们并不认为所述协议优于其他协议，但我们认为有机会更广泛地应用一些方法，以帮助提高生产力、护理或效率。这一点尤其正确，因为我们的育种是在室内实验室条件下进行的，空间有限，类似于涉及尤菲德里亚·拉伊达·泰莱伊和斯佩里亚·泽雷内河马^17、23的保护计划。许多其他协议通常使用盆栽材料进行排卵或幼虫饲养，这有时会导致与捕食者控制、环境控制（即湿度、温度）、牲畜监测、数据收集、植物害虫问题和空间相关的复杂性增加，仅举几例^21、22。最后，提出了方案概述了圈养繁殖的方法。许多其他风险蝴蝶保护计划涉及头启动或圈养饲养，具有代表性的协议反映了这些差异。虽然通常很小，但我们认为这有助于扩大现有可用信息库，供其他计划审查。这一点至关重要，因为大多数异地项目都是为帮助恢复稀有且往往研究不善的分类税而开创性的努力。可用的协议可以作为一个极好的起点，帮助提供有价值的见解，减少重复工作，并促进创新。由于”蝴蝶行为、生命历史特征和生态要求的广泛差异，加上项目设施、预算、从业人员专业知识等往往存在显著差异”等内在差异，依赖单一方法，甚至对于密切相关的分类，往往存在限制和无理的³⁰种差异。灵活改进或开发适合特定分类或计划需求的新协议对于成功至关重要，因此应予以强调。我们还将描述实验室技术，用于收集在圈养条件下的有机体发育指标，包括幼虫星的数量、个体发育阶段的持续时间、总发育时间以及幼虫和幼虫长度。这些技术对Lepidoptera的生命史研究具有广泛的适用性，可用于改进原位协议或为现场数据提供信息。

Protocol

1. 确保成功的成人求爱和交配 成功放飞后，将存活的成年蝴蝶释放到位于温度控制的温室中的安全、步入式、经过筛选的飞行笼中（附图2）。注：如果需要识别特定个体以分离遗传系、种群来源或与生物体寿命、行为、行为、相关特定数据，则可以在翅膀的腹腔表面用永久性油墨标记标记成人，等。 虽然确切的笼子尺寸可能有所不同，但确保有足够的空间来容纳足够的花蜜植物材料，以支持成年蝴蝶的密度，并为人类提供自由站立和旋转的空间。 除了温度调节外，确保温室安全，以便提供第二层密封，同时防止恶劣天气（如大雨、大风）。 提升盆栽花蜜植物材料，使从笼子内顶部到最高开花的花朵不超过30厘米的空间（补充图2）。这提供了对可用花蜜资源的最佳访问，提供了充足的成人栖息，并最大限度地减少了多余的飞行活动。 将一盆盆栽植物放在飞行笼中。这可确保即使错过一对交配对，也可以收集任何产下卵子。 提供一致的气流。这增强了求爱活动和交配成功。在温室环境中，鼓风机和固定安装循环风扇最适合帮助增强通风和空气运动。也可以使用较小的便携式通风，如盒子或台式风扇。 保持27°C至32°C之间的温室内部温度，促进最佳的成人活性和交配成功。使用可追踪的内存监控温度计监控保持架内的温度。 使用手动泵、塑料罐喷雾器或花园软管，定期用水雾化经过筛选的飞行笼（大约每 2 小时一次）。 使用50 dram透明塑料扣帽小瓶（材料表）从屏蔽飞行笼中轻轻收集单独的交配对，每瓶放置一至两对，并运送到室内饲养室或实验室（补充图3）。 2. 最大化鸡蛋生产 组装排卵室。 拿一个12盎司的普通白纸杯，用一把扣刀片实用刀，在杯子的两侧相互切开两个水平切口。每个切口应比轮缘低约 1 厘米。 将单棉签切成两半，将每个棉签端插入纸杯两侧的两个水平切口中，使棉签部分向杯内部延伸约 2 厘米。 使用卡刀实用刀，在纸杯底部进行两个”X”切口。每个对角线切割应约 1 厘米长。 拿一个9盎司的塑料杯，用大约2厘米的自来水填充底部。 将茎插入底部的”X”切口，将新切割的、约 15 厘米长的终端幼虫宿主植物生长放入纸杯中。将阀杆穿过切口，使底部伸出约 4-5 厘米。 将带有宿主材料的纸杯放入塑料杯中，确保植物杆在水中。 将 1 ml 子 Q 注射器（0.45 mm x 16 mm）装满调味运动饮料，并在纸杯中使两个棉签饱和。这些充当人造花。注：甜瓜和水果冲剂运动饮料提供最好的花蜜替代品。 一旦每个交配对分离，将2-3个重力雌性放入组装的杯配置（即，排卵室）。 用黑色薄纱的切割方形碎片盖住杯子（约 15 厘米 x 15 厘米），并在盖子周围用橡皮筋固定，（补充图 4）。黑色薄纱提供对杯子的最佳可见性，并可轻松识别偶尔在薄纱上放置的任何鸡蛋。 刺激成年蝴蝶的活动和排卵。 将每个排卵室放在实验室工作台或桌子上，温度低于 8.5 英寸（21.59 厘米）的夹钳灯约 19 厘米，带有铝反射器，可安装 40 W 白炽灯泡（补充图 5）。注：白炽灯提供刺激成人活动和排卵所需的辐射热。 将可追踪的内存监控温度计放在灯旁边，并运行温度传感器，使其位于直位于钳灯下的波排室顶部。注：目标温度范围在27.5 °C-29 °C之间。 根据需要添加补充夹紧灯，具体取决于部署的排卵室总数。 将夹紧灯插入可编程的 15 安培 24 h 室内插入式机械定时器中，带两个插座（可定时间隔 30 分钟）。 设置定时器以打开夹钳灯 30 分钟间隔（即可重复循环 30 分钟开，30 分钟关闭）。注：此光循环通过提供可重复的照明周期来刺激成年蝴蝶的活动和排卵，然后是短的暗休息期，从而有助于最大化卵子生产。 通过子Q注射器用调味运动饮料刷新每个杯子中的棉签，并定期用水雾气，大约每2-3小时或根据需要使用塑料喷雾瓶。注：这提供了足够的人工花蜜和水分，使蝴蝶可以根据需要自由喂养。因此，在难以利用生活、开花植物材料的实验室条件下，它提高了成人的寿命和排卵生产率。 定期监控杯，必要时用新切屑更换主机。 当卵子开始孵化或卵子密度变高时，将雌性卵子移到一个有新鲜宿主的新杯子中，开始与新生儿进行幼虫治疗。 3. 幼虫护理和维护 重复步骤 2.3-2.6 组装幼虫杯。 当卵子开始孵化时，将带鸡蛋和新生儿幼虫的宿主植物材料移入新组装的杯子中，将茎穿过底部的第二个”X”，确保植物茎在水中，并留下接触相邻的新鲜宿主切割。 当幼虫幼虫幼虫幼虫幼虫杯时，每天检查幼虫杯是否新鲜，以及存在霉菌或过量的乳酸。注意：当幼虫幼年时，不建议每天去除宿主材料，因为这可能导致由于处理和/或不必要的新鲜宿主材料浪费而造成有机体损伤。 如果宿主材料枯萎或条件较差，将另一种新鲜宿主材料切割到杯子中，以便它接触现有的叶子，让幼虫自行移动到新的宿主。 一旦幼虫到达第三星，更换纸杯，每天添加新鲜的宿主材料。 使用小骆驼毛水彩画笔将幼虫从旧宿主材料或杯表面轻轻移动到新杯中新鲜的宿主材料。 将旧主机材料放入空的矩形塑料食品储存容器中。 每天重复步骤3.5-3.7，直到处理所有带有幼虫的杯子。 完成后，在食品储存容器的植物废物顶部添加少量新鲜宿主材料，并在顶部松散地放置盖子。注：在日常处理过程中，任何幼虫都会被忽视，因为它们会爬到植物废物顶部的新宿主材料上，第二天即可清除，这可作为保护。 在实验室温度25°C-28°C之间保持杯子，以获得最佳幼虫活性和发育（补充图6）。注：为了在室内条件下达到最佳的饲养温度，通常需要将杯子放在装有 40 W 白炽灯泡的铝反射器下。然后，可以使用可追溯的内存监控温度计主动监控温度，并调整光高以达到最佳的饲养条件。 4. 建造小狗室 将单面波纹纸卷切成大小相等的 3.8 厘米 x 3.8 厘米正方形。 将一个正方形放入 2 盎司透明塑料部分杯中。 将杯子放在一个透明塑料杯托盘上（补充图7）。 5. 为幼虫准备幼虫 识别成熟的幼虫，准备在日常菌落处理过程中幼虫繁殖。注意：这种幼虫会变成一个均匀的沉闷的绿褐色，失去它们的长须，并经常游离主机。 用小骆驼毛水彩刷或钳子轻轻去除每个成熟的幼虫，并在每个幼崽室中放置一个。 牢牢将透明塑料盖卡在小狗室上。 重复步骤5.1-5.3，直到所有准备幼虫的幼虫都转移到幼虫室，根据需要添加新的塑料托盘（补充图8）。 6. 维护 pupae 对于每个托盘的小狗室，记录第一次小狗的日期和任何其他相关信息需要（即遗传线，实验试验等）。 按日期将托盘组织在实验室内的安全位置（补充图8）。 每天监测托盘，以进行成人环状。注：实验室条件（如温度）将严重影响开发时间。 在成人下架之前（通常在首次小狗的10天内），从单个小狗室取下盖子，并将托盘放在34.29厘米x34.29厘米x60.96厘米可折叠网状弹出式饲养笼中（补充图9）。注：Pupae牢固地固定在波纹纸方块的凹槽中，有助于成功成人环状（补充图10）。 对后续强制生成重复步骤 1.1 中的整个协议。 7. 评估不成熟阶段的发展时间和发育点数量 将单个幼虫放在解剖显微镜下。使用小骆驼毛水彩刷仔细移动和分离幼虫，以避免对生物体的伤害。 将画笔的单发浸入无毒发光涂料（材料表），并小心地在幼虫的背面（二十一）上放一小滴油漆。使用从幼虫的背景颜色和图案颜色中脱颖而出的油漆颜色（补充图11）。一定要避免在幼虫的头上涂上油漆。 一旦油漆干燥（约30s左右），将每只幼虫放在自己的2盎司透明塑料部分杯中，里面装有大约1⁄3小叶的新鲜终端宿主材料，并在杯子和盖子上写一个唯一的标识符（补充图12）。 <!–Place approximately 1-3 small leaves of fresh terminal host material into each cup with larva and firmly secure the lid.–> 每天仔细检查每个幼虫。去除叶子并设置在白色表面上。检查杯子，清除盖子，并在解剖显微镜下检查叶子是否存在幼虫渗出（铸造皮肤）和/或头胶囊。 如果发现幼虫，请将其从杯子中取出，并将其放入标有相应杯号和日期的微离心管中（参见下面的步骤 8.1-8.6）。 在每个蜕皮和记录蜕皮日期后重新绘制幼虫。 每天使用数字卡钳测量每个幼虫的总身体长度（头到最后腹部段）。进行三次测量，并记录三个测量值的平均值以及日期和时间。对于早期星幼虫，在测量时应使用放大镜或解剖范围，以确保测量准确。 将幼虫返回到其相应的塑料部分杯。 根据需要添加新鲜的主机材料，并清除所有 fras 和旧主机碎屑。如果在杯子中发现霉菌，则处理并使用新杯子。在新杯子上写上正确的唯一标识符编号。 重复步骤7.5-7.9，直到所有幼虫到达其最终的星中，并开始前期阶段。当幼虫停止进食时，变成均匀的沉闷的绿褐色，失去它们的长方形，并经常游离宿主，尽量减少干扰它们。 在杯子中放置一小块瓦楞纸（参见步骤 4.1）。 一旦每个幼虫完全幼虫，测量其总长度，如上文步骤7.8，并记录幼崽的日期。这将是每个人最后的蜕皮。 每天检查pupae，并记录每只成年蝴蝶的结其体日期和性别。 使用数字卡钳测量每只蝴蝶的翼弦长度。蝴蝶可以轻轻地用钳子进行测量。如果蝴蝶太活跃，无法轻松测量，请暂时将其放入冰箱 30 s 或更少，然后重试。 8. 收集幼虫渗出物 当观察到幼虫渗出菌时，用0.2μl的甘油填充微离心管。用幼虫编号、软糖日期和头部胶囊（H.C.）标记盖子顶部和侧面。注：一些白鳍豚幼虫的幼虫经常消耗其外宣，但头胶囊应保留。 将幼虫体和相关的头胶囊放入透明塑料部分杯盖中，放入几滴乙醇。 在解剖显微镜下检查幼虫体，将其放入透明塑料部分杯盖，并在其上放置几滴乙醇。如果幼虫头胶囊已经与外膜分离，将一滴甘油放在尖的昆虫力尖上，然后轻轻地将头胶囊触摸到甘油。将头胶囊放入相关的微离心管中。 如果头胶囊仍然附着在幼虫上，使用尖钳和昆虫针将头胶囊与幼虫渗漏分离。 一旦分离，使用甘油技术拿起头胶囊。如果乙醇过多，可以使用小纸巾取出一些，但小心不要意外取出头部胶囊。 将头胶囊放在标有甘油填充小瓶中，并紧闭盖子。

Representative Results

在2003年2月至2010年12月和2016年11月至今的两项针对Cyclargus thomasi Bethunebakeri恢复的单独养护举措中，该议定书成功地生产了超过51 052种活生物体。根据2018年6月至2019年6月总体圈养种群生产力的一年汇总快照，共生产了10，166种活生物体，相当于13代人中每月782.00至118.93个生物。同样，在实验室条件下，每名女性的平均卵子总产量为114.00 ± 26.12 （n = 12）31。由此产生的大量有机体生产力将该计划列为美国最大的此类异地工作之一，以及尤菲德里亚·迪塔·塔洛伊、斯佩耶里亚·泽雷内·河马和莱凯伊德斯·梅利萨·萨缪利斯24。部分生产力可以归因于蝴蝶不断育雏，大约每4-6周繁殖一代。大多数其他保护性育种计划涉及单伏特或双伏特的分类。尽管如此，即使对于涉及极度粪便的项目，如Speyeria spp.，每年为保护迁移而生产的活生物体总数也很少超过几千个。因此，我们的圈养种群能够对许多关键数据差距进行定向研究和广泛数据收集，这些差距对于改善最佳实验室育种和饲养实践（图1）以及帮助制定恢复和管理决策也非常重要。 从新生儿幼虫到成人的平均发育时间为28.63天（表1）。大多数幼虫有4个软糖（图2，图3），虽然其中两个有5个软糖，一个有6个软糖。所有幼虫星的总平均长度为5.97毫米，幼虫在第四和前期生命阶段最大（表1）。当只包括超过30个观测值的变量时，最短的时间在第一个星和前期阶段花费，最长的花费作为pupae（表1，图2）。女性通常在所有不成熟阶段比男性发育得更快，尽管这不是显著的影响（p = 0.625）。统计分析使用 RStudio 版本 1.1.463 （R 核心团队 2016）33。成人翼弦的平均长度为12.64毫米（表2），两性之间存在显著差异（p = 0.047）。进行双面t测试是为了评估两性之间的翼弦差异。线性回归模型和每个生命阶段平均长度的逐步回归表明，pupal长度是成人翼弦长度的最佳预测变量（表3，表4）。开发时间的回归模型显示，第二星和第四星的天数和总天数是成人翼弦长度的最佳预测变量，但只有第四星的天数显著（表5，表6）。由于变量是连续的，因此在每个生命阶段的开发时间以及每个生命阶段的长度运行两个线性回归模型，成人翼弦长度作为因变量。在两个回归模型上运行逐步回归，以确定成人翼弦长度的最佳预测变量。 补充图1：成年赛克拉古斯·托马斯·贝图恩贝耶里固定标本。（A） 成年男性、背纹（左）、腹腔（右）。（B） 成年女性，背（左），腹腔（右）。请点击此处查看此图的较大版本。 补充图2：在温控温室内饲养的屏蔽飞行笼。（A） 内部显示盆栽成年花蜜植物和单个盆栽幼虫宿主植物。（B） 金属搁板有助于提升盆栽花蜜植物，使从笼子内顶到最高盛开的花朵的空间不超过30厘米。请点击此处查看此图的较大版本。 补充图3：收集成人对的程序。（A） 在经过筛选的飞行笼内（女性、右侧和男性，左侧）内交配的成年Cyclargus Thomasi Bethunebakeri。（B） 从飞行笼中收集的交配对，用扣帽小瓶，带到实验室。请点击此处查看此图的较大版本。 补充图4：装配排卵室的程序。（A） 两个杯子系统，带有终端主机材料和棉签。（B） 一个1ml亚Q注射器（0.45毫米x16毫米），有调味运动饮料饱和棉签在纸杯。（C） 杯壳肉女性用黑色薄纱固定。请点击此处查看此图的较大版本。 补充图5：实验室设置，以最大限度地提高鸡蛋生产。（A） 在带有40W白炽灯泡的夹子灯下放在实验室工作台上的排卵室。（B） 可追踪记忆监测温度计放置在灯光附近，温度传感器位于直位于钳灯下的排卵室顶部。（C） 一个1ml子Q注射器和小烧杯，放在排卵室附近，以便于全天定期刷新棉签。请点击此处查看此图的较大版本。 补充图6：幼虫护理和维护实验室设置。（A） 两个杯子系统，每个系统都含有新鲜的终端宿主材料和幼虫。（B） 杯中的温度保持在 25°C-28 °C 之间，以获得最佳的幼虫活性，并通过具有 40 W 白炽灯泡的顶式夹灯进行发育。（C） 可追踪记忆监测温度计，温度传感器直接放在杯子内，用于监测温度。请点击此处查看此图的较大版本。 补充图7：制备的小狗室。（A） 单个塑料部分杯放在透明塑料杯托盘上。（B） 每个塑料部分杯上都放置一个瓦楞纸方块。（C） 单个成熟的幼虫将放置在每个准备好的塑料部分杯中，以幼虫。请点击此处查看此图的较大版本。 补充图8：为幼虫和幼虫的维持做准备。（A） 成熟的幼虫准备在瓦楞纸上幼虫。这是一个统一沉闷的绿褐色，已经失去了任何长方形。（B） 幼虫室准备接收与喂食幼虫相邻的成熟幼虫。所有有盖子的幼虫室，准备幼虫。（C） 带小狗的小狗室.（D） 以日期组织并在实验室条件下维持的小狗室的舱。请点击此处查看此图的较大版本。 补充图9：实验室出现笼。（A） 可折叠的网状弹出饲养笼，容纳被占用的小狗室。（B） 所有小狗室的盖子被移走，以利于成功成人的环状。（C） 所有可存活的成年蝴蝶将被释放到经过筛选的飞行笼中，以确保成功交配。请点击此处查看此图的较大版本。 补充图10：成年雄性蝴蝶在瓦楞纸广场上成功地从pupa上分离。（A） 成人从pupa中退出.（B） 成人完全从阴管中取出。（C） 成人定位以展开翅膀.（D） 成人展翅。请点击此处查看此图的较大版本。 补充图11：第五星幼虫，标有无毒发光漆。（A） 用画笔在地头放置一小滴对比红、无毒的发光涂料，以成功标记幼虫。请点击此处查看此图的较大版本。 补充图12：生命史研究的饲养设置。（A） 唯一标记的 2 盎司透明塑料部分杯。（B） 每个杯子中都隔离一只幼虫.（C） 所有幼虫都分别跟踪从新生儿到成年蝴蝶的所有发育阶段。请点击此处查看此图的较大版本。 图1：在位于温度控制的温室中，根据温度（°C）记录的对数。温度记录在成功配对事件（n = 411）的前 2 分钟内。所得数据用于帮助优化受控环境条件，以最大限度地提高交配成功，并最终提高捕获繁殖的整体生产力。请点击此处查看此图的较大版本。 图2：每个不成熟生命阶段的平均开发时间（天数）。（A） 条形显示每个组的平均值，误差条表示每个组的上下标准差值。（B） 深蓝色条代表女性，浅蓝色代表男性。请点击此处查看此图的较大版本。 图3：使用生命史协议从单个#25收集头胶囊。头胶囊由约翰纳森布雷默使用自动蒙太奇系统拍摄。请点击此处查看此图的较大版本。 生命阶段 平均体长（毫米） 条子差（长度） 平均开发时间（数天） St. 错误（开发时间） Instar I 1.69478261 （n=23） 0.02152643 2.90625 （n=32） 0.08229783 Instar II 2.77248958 （n=32） 0.04302826 3.375 （n=32） 0.16649857 因斯塔三号 5.45751042 （n=32） 0.12120829 3.5 （n=32） 0.20080483 Instar IV 10.2369688 （n=32） 0.23653991 3.875 （n=32） 0.18917265 Instar V 8.7625 （n=2） 2.6125 1.5 （n=2） 0.5 因斯塔六号 10.2666667 （n=1） 那 3 （n=1） 那 前普帕 11.0858333 （n=24） 0.23948251 2.9375 （n=32） 0.21504641 蛹 9.0316129 （n=31） 0.12106792 11.6578947 （n=38） 0.3272288 表1：每个生命阶段的平均长度和发展时间。包括每个变量的标准误差，以及括号中的示例大小。 生命阶段 平均翼弦长度（毫米） Std 错误 成人 12.63895 （n=38） 0.1365516 女性 12.960 （n=13） 0.1465588 男性 12.472 （n=25） 0.1863205 表2：成年蝴蝶的平均前翼翼弦长度。包括女性、男性和所有成年人（两性加起来）的手段。 LM 型号 1 估计误差 t 值 p 值 拦截 1.9179 3.128 0.0046 ** 平均长度第二星 0.6822 -1.11 0.278 平均长度第三星 0.2928 0.476 0.6381 平均长度第四星 0.1373 -0.57 0.5739 平均长度 0.246 3.957 0.0005 *** p < 0.001;* p < 0.01;• p < 0.05。 表 3：线性回归模型 （LM 模型 1） 的系数表，用于评估每个生命阶段的平均长度（分析中包括的 n > 30）与成人翼弦长度之间的关系。因变量：成人翼弦长度（毫米）。 系数 估计误差 t 值 Pr（>\t_） 拦截 1.7091 3.031 0.0053 ** 平均长度 0.1878 4.414 0.0002 *** 表4：逐步回归（逐步回归1）。因变量：成人翼弦长度（毫米）。 LM 型号 2 估计误差 t 值 p 值 拦截 1.1888 12.643 4.21e-12 | 数. 第一星号天数 0.3486 0.937 0.3583 数. 天数第二星 0.2603 -0.686 0.4993 数天第三星 0.2281 1.028 0.3141 数. 第四星 0.2048 2.378 0.0257 * 前普帕的天数 0.222 1.133 0.2686 数天 0.2495 0.616 0.5435 总天数 0.1913 -1.454 0.1589 p < 0.001;* p < 0.01;• p < 0.05。 表5：线性回归模型（LM模型2）的系数表，用于评估发育时间与成人翼弦长度之间的关系。因变量：成人翼弦长度（毫米）。 系数 估计误差 t 值 p 值 拦截 0.89304 16.314 7.86e-16 | 数. 天数第二星 0.17974 -1.809 0.0811 | 数. 第四星 0.16917 2.075 0.0473 * 总天数 0.04184 -1.787 0.0848 | p < 0.001;* p < 0.01;• p < 0.05;• p < 0.1 表6：开发时间的逐步回归（逐步2）。因变量：成人翼弦长度（毫米）。

Discussion

在这里，我们演示了这种经过验证的原地保护育种协议对大规模生产危险蝴蝶的有效性，以及如何将其应用于科学研究，以帮助解决关键的行为、生命史或生态数据差距。增加对平均总发育时间（卵子到成人）的理解，每个生命阶段的平均持续时间，以及交配的最佳温度，例如，用于帮助完善协议和提高整体计划的成功。绝大多数现有协议只详细说明有机体的饲养方法，不讨论数据收集、科学研究或利用这些结果来帮助提供信息和可能适应异地方法。

该协议要求日常有机体饲养。有机体的健康和生产力通过清洁的饲养条件、缺乏生物过度拥挤以及高质量幼虫宿主植物材料的提供而最大化。在大多数情况下，我们使用一次性饲养用品和容器（例如纸张和塑料杯），通常定期更换，通常每天更换，从不重复使用材料。这既具有成本效益，又最大限度地减少了对更劳动密集型材料卫生的需求。然而，常用的工具，如昆虫钳、水彩油漆刷、小型弹出式飞行笼，以及所有饲养表面（如桌面和实验室台面）均使用 5% 漂白溶液定期消毒。卫生的确切时间表高度依赖于使用频率、有机体现象和其他变量，并且应根据每个异地计划的具体需要进行定制。我们还发现，白色的屠夫纸是有用的覆盖所有饲养表面。它提供廉价、易于部署的清洁基材，白色背景色便于发现任何杂散生物。对于日常饲养，所有实验室人员应始终佩戴一次性实验室检查手套，以尽量减少污染，并保护人员免受植物或有机物处理造成的任何潜在皮肤刺激。如果任何实验室人员有需要局部跳蚤治疗的家用宠物，这一点尤其重要。即使是少量的活性成分残留物也会对圈养牲畜造成危害。

此外，应注意尽量减少生物过度拥挤。幼虫过度拥挤会迅速导致某些分类的有机体健康下降，甚至食人族，特别是利卡尼达。根据协议生命史部分所述，定期分离幼虫以减少饲养容器内的数量减少和/甚至分离单个幼虫。每个容器的理想数量可能因特定的分类和各种异地计划限制而有很大差异，例如可用预算、实验室设施和畜牧人员总数。我们同样建议在杯子之间留出足够的空间来容纳幼虫，以尽量减少容器之间有机体移动的可能性。最后，对于较大的圈养种群，强烈建议在一个或多个实验室设施之间分离库存。这种保护战略有助于尽量减少由于疾病或其他不可预见的影响而造成整个人口的灾难性损失。

幼虫宿主植物的质量和可用性推动畜牧业生产，并严重影响幼虫发育率和总体人口健康。尽管如此，很少有发表的报告或研究强调这一后台要求或讨论最佳育婴做法。成功的现场计划必须考虑足够的工厂数量、生产和维护。由于许多幼虫也要求或更喜欢某些植物部件（例如，终端新生长、花蕾和花序、水果等），因此需要有效的分期，以确保需要适当的植物性。

其他考虑因素包括适当的人口和遗传管理，以及尽量减少圈养的任何潜在负面影响。我们建议制定基因管理计划。这可能包括定期注入新的遗传物质、最大化多样性和防止近亲繁殖、定期评估关键生物体适应性变量以及某种程度的遗传学监测，以便与现有种群进行比较并检查圈养种群健康等战略。定期比较被俘个人与创始人口中个体的特征，也有必要^{进行34，35。}

这些协议代表了经过验证的最佳做法。它们应该有利于各种研究人员和保护实践者，他们可以直接应用或调整我们的方法，以适应他们自己的研究，以及异地风险蝴蝶或昆虫的养护和恢复计划。具体概述的圈养繁殖协议可能最适用于专注于其他Lycaenidae、相关分类或较小尺寸的分类程序。尽管如此，许多组成部分，如那些涉及确保成功的求爱和交配，成人维护与人工花蜜，最大化排卵，和一般幼虫护理可以可以说更广泛地应用或适应更广泛的阵列税。如前所述，虽然应强调议定书的灵活性，但获得其他既定方法有助于提供宝贵的见解，并为适应和创新提供可行的出发点。用于评估各种生命历史特征的方法，如幼虫发育时间和幼虫幼虫数量，可以说对其他保护性育种项目和风险分类具有广泛的适用性。我们鼓励其他人尽可能帮助解决关键的生态数据差距，并发布经过审核的协议和计划结果。

Materials

12 oz plain white paper cups (Karat)	Lollicup	C-KC16
15-Amp 2-Outlet Mechanical Residential Plug-in Countdown Lighting Timer	Lowes	UTTNI2423
1ml sub-Q syringes (0.45 mm x 16 mm)	Fisher Scientific	14-829-10F
2 oz clear plastic portion cup lids	Party City	#791091
2 oz Clear Plastic Portion Cups	Party City	#791088
34.29 cm x 34.29 cm x 60.96 cm collapsible mesh popup rearing cage	Bioquip	1466BV
8.5" 1-Watt Incandescent Clamped Work Light	Lowes	PTC301L
Adoric Electronic Digital Caliper	Amazon.com	B07QX2SK2F
Big Kid's Choice Arts & Crafts Brush Set-12/Pkg, assorted sizes	Walmart	#10965135
Clear Plastic Cup Tray	Frontier Scientific Services	AG_9040
Fisher Scientific traceable memory monitoring thermometer	Fisher Scientific	15-077-8D
Forceps, Straight Points, Swiss Style #4, Stainless	BioQuip	4531
Humco Glycerin 6 oz	Walmart	#303951037966
Luminous Paint Kit, Blue, Red, Yellow, 4 Dram	Bioquip	1166A
Melon flavored Gatorade Fierce Thirst Quencher or fruit punch flavored Gatorade Thirst Quencher sports drink	Walmart	#568456137
Neoteck Digital 2 in 1 Hygrometer-Thermometer	Amazon.com	NTK026
Olympus 0.6 ml Microtubes, Clear, Polypropylene, Nonsterile	Amazon.com	24-272C
Plastic Tank Sprayer	Lowes	#5318
Q-tips Cotton swabs	Walmart	#551398298
Rectangular plastic tupperware container with lid (Rubbermaid)	Walmart	#554320171
Showgard 903 Stamp Tongs, 4 5/8 inch Spade Tip	Amazon.com	#787793151378
Single face corrugated paper roll	Amazon.com	BXSF12
Snap blade utility knife	OLFA	#5023
Solo 9 oz plastic cups	Solo	SQ950
Thorton Plastics 50 dram clear plastic snap cap vial (6.25 oz.)	Thorton Plastics	#50
Tulle Spool 9 inch x 150 feet – Black	Jo Ann Fabrics	#16029696
Zep 32 oz Plastic Spray Bottle	Lowes	HDPRO36