Visualisere den udviklende hjerne i levende zebrafisk ved hjælp af Brainbow og Time-lapse Konfokal Imaging
Summary
In vivo imaging er et kraftfuldt værktøj, der kan bruges til at undersøge de cellulære mekanismer underliggende nervesystem udvikling. Her beskriver vi en teknik til at bruge time-lapse konfokal mikroskopi til at visualisere et stort antal flerfarvede Brainbow-mærkede celler i realtid inden for udviklingen zebrafisk nervesystem.
Abstract
Udvikling af hvirveldyr nervesystemet kræver en præcis koordinering af komplekse cellulære adfærd og interaktioner. Brugen af in vivobilledteknikker med høj opløsning kan give et klart vindue ind i disse processer i den levende organisme. For eksempel kan dividere celler og deres afkom følges i realtid som nervesystemet former. I de seneste år har tekniske fremskridt inden for flerfarvede teknikker udvidet de typer af spørgsmål, der kan undersøges. Den flerfarvede Brainbow tilgang kan bruges til ikke kun at skelne mellem lignende celler, men også til farvekode flere forskellige kloner af relaterede celler, der hver stammer fra en progenitor celle. Dette giver mulighed for en multiplex afstamning analyse af mange forskellige kloner og deres adfærd samtidig under udviklingen. Her beskriver vi en teknik til at bruge time-lapse konfokal mikroskopi til at visualisere et stort antal flerfarvede Brainbow-mærkede celler over realtid inden for udviklingen zebrafisk nervesystem. Dette er især nyttigt til at følge cellulære interaktioner mellem lignende celler, som er vanskelige at mærke differentieret ved hjælp af traditionelle promotor-drevne farver. Vores tilgang kan bruges til sporing afstamning relationer mellem flere forskellige kloner samtidigt. De store datasæt, der genereres ved hjælp af denne teknik, giver omfattende oplysninger, der kan sammenlignes kvantitativt på tværs af genetiske eller farmakologiske manipulationer. I sidste ende de genererede resultater kan bidrage til at besvare systematiske spørgsmål om, hvordan nervesystemet udvikler sig.
Introduction
I de tidlige faser af udviklingen, puljer af specialiserede sogenitor celler deler gentagne gange i proliferativ zoner, der producerer forskellige arrays af datter celler. Cellerne født i denne udviklingsperiode vil derefter differentiere og rejse til at danne de spirende organer. I nervesystemet, progenitors såsom radial glia give anledning til umodne neuroner i ventrikulære zoner. Som neuroner migrere væk fra hjertekamrene og modne, den ekspanderende væv i sidste ende danner meget komplekse strukturer i hjernen1,2,,3,4,5,6. Koordineringen mellem opdeling af sformere og differentiering og migration af neuroner vil bestemme den endelige størrelse, form, og dermed funktion af hjernen, direkte påvirker adfærd7,8,9,10. Mens stram kontrol over disse processer er klart afgørende for normal hjerneudvikling, de globale mekanismer, der regulerer disse dynamikker er ikke godt forstået. Her beskriver vi et værktøj til at studere nervesystemet udvikling på en cellulær opløsning, så forskerne til at visualisere stamcelleceller og neuroner in vivo i udviklingslandene zebrafisk hjernen med Brainbow og spore deres adfærd over tid via time-lapse konfokal mikroskopi11. Tilgangen kan også tilpasses til at visualisere andre dele af det udviklende embryo.
At observere og skelne mellem celler i den udviklende zebrafisk hjerne, har vi tilpasset Brainbow celle-mærkning teknik11. Brainbow udnytter tilfældigt bestemt, kombinatorisk udtryk af tre forskellige fluorescerende proteiner (FPs) til at mærke en population af celler. Mens standardudtrykket for Brainbow-ekspression er den røde FP dTomato, resulterer rekombination af enzymet Cre recombinase i udtryk for mCerulean (cyan fluorescerende protein, CFP) eller gult fluorescerende protein (YFP)12,13. Den samlede mængde af hver FP udtrykt i en celle giver det en unik nuance, så klar visuel skelnen fra tilstødende celler. Derudover, når en stamcelle deler sig, vil hver dattercelle arve farven fra sin modercelle, der producerer farvekodede kloner og giver forskerne mulighed for at spore celleafstamning11,14. Mens oprindeligt bruges til at analysere neuronal kredsløb i mus12, Brainbow er siden blevet udtrykt i en bred vifte af model organismer, herunder zebrafisk15.
Vores teknik bygger på tidligere flerfarvede mærknings- og billedbehandlingsmetoder til direkte at afbilde flere farvekodede kloner over tid i levende zebrafisk. På grund af deres optiske gennemsigtighed som embryoner er zebrafisk velegnede til billeddiagnostiske eksperimenter16, og tidligere undersøgelser har udnyttet Brainbow i zebrafisk til at studere en række væv, herunder nervesystemet11,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. Evnen til direkte billede i den levende organisme, sammen med deres hurtige ex utero udvikling, gør zebrafisk en værdifuld model for hvirveldyr udvikling. I modsætning til pattedyr hjernen, hele spredningzone zebrafisk baghjernen er let tilgængelige for billeddannelse uden afbrydelse af dens endogene miljø6. Dette gør det muligt at udføre forsøg i den levende organisme i stedet for i in vitro- eller faste vævspræparater. I modsætning til faste billeddiagnostiske eksperimenter giver in vivo-undersøgelser mulighed for et langsgående design, der producerer timevis af data, der kan analyseres for mønstre, hvilket øger sandsynligheden for at observere relativt sjældne hændelser. Afhængigt af hastigheden og længden af de begivenheder af interesse, kan forskerne vælge at udføre korte (1-2 h) eller lang (op til ~ 16 h) time-lapse billeddannelse eksperimenter. Ved at bruge zebrafisk varmechok promotor 70 (hsp70, hsp), Brainbow udtryk kan være tidsmæssigt kontrolleret28,29. Derudover mosaik udtryk induceret af denne promotor er velegnet til mærkning og sporing mange kloner11.
Evnen til visuelt at identificere flere kloner i den levende hjerne er en fordel ved denne metode. Vigtige tidligere undersøgelser, der undersøgte den rolle, kloner inden for udvikling af nervesystemet udnyttet retrovirale vektorer til at mærke en enkelt progenitor celle og dens afkom ved hjælp af en enkelt FP eller andre let visualiseret protein. En sådan mærkning gør det muligt for forskere at observere en enkelt klon over tid, enten in vitro eller in vivo2,30,31,32,33,34,35,36,37,38. I modsætning til metoder til at spore adfærd celler inden for en klon, de forskellige farver Brainbow giver forskerne mulighed for at observere dynamik blandt kloner. Derudover, ved hjælp af Brainbow at mærke mange kloner i hjernen, yderligere data om klonale adfærd indsamles i forhold til teknikker, der etiketten en enkelt klon11. Det er vigtigt, at de metoder, der er beskrevet her, kan udvides til at generere udviklingssammenligninger mellem fisk, der har gennemgået forskellige genetiske eller farmakologiske manipulationer18. Samlet set disse fordele gør time-lapse i vivo konfokale billeddannelse af Brainbow-udtrykke zebrafisk ideel til forskere udforske udviklingen af hvirveldyr nervesystem, især dem interesseret i den rolle, kloner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver en metode til at visualisere kloner af stamcelleceller og neuroner i den udviklende zebrafisk baghjerne og følge dem in vivo ved hjælp af Brainbow og time-lapse konfokal mikroskopi11. Den største fordel ved denne protokol i forhold til in vitro- eller ex vivo-undersøgelser er evnen til direkte at observere hvirveldyrhjernens proliferativzone i dens naturlige miljø over tid. Denne teknik bygger på tidligere undersøgelser, der mærkede en enkelt klon ved hjælp af ret…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Y. A. Pan, J. Livet og Z. Tobias for tekniske og intellektuelle bidrag. Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation (Award 1553764) og MJ Murdock Charitable Trust.
Materials
| 1.5mL transfer pipet | Globe Scientific, Inc. | 134020 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Alfa Aesar | L06690 | Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation |
| 50ml conical tubes | Corning | 352070 | For heat shocking embryos |
| 6 lb nylon fishing line | SecureLine | NMT250 | For making embryo manipulators |
| 7.5mL transfer pipet | Globe Scientific, Inc. | 135010 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | For E3 |
| Cotton swabs | Puritan | 867-WC NO GLUE | For making embryo manipulators |
| Cre recombinase | New England Biolabs | M0298M | |
| Digital dry bath | Genemate | 490016-616 | Used to store LMA at 40°C |
| Epifluorescence dissection scope | |||
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Incubator | Forma Scientific | 3158 | To maintain embryos at 28°C |
| Injection plate molds | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Isotemp water bath | Fisher Scientific | 2320 | For heat shocking embryos |
| KCl | AMRESCO | 0395 | For E3 and for DNA solution for injections |
| Laser-scanning confocal microscope | Zeiss | LSM710 | |
| LE agarose | Genemate | E3120 | To create agarose injection plates |
| Low-melt agarose (LMA) | AMRESCO | J234 | |
| Mating tanks | Aquaneering, Inc. | ZHCT100 | |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | For E3 |
| MgSO4 | Sigma | 9397 | For E3 |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| MS-222 Tricaine-S | Western Chemical, Inc. | Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | For E3 |
| Petri dishes (90 mm, 60 mm) | Genesee Scientific | 32-107G | To house embryos and create imaging chamber (60 mm) |
| Phenol red | Sigma | P0290 | |
| Soft stitch ring markers | Clover Needlecraft, Inc. | 354 | For creating imaging chamber with Petri dish |
| Super glue (Ultra gel control) | Loctite | 1363589 | For making embryo manipulators |
| Syringe needles | Beckton Dickinson | BD329412 | For dechorionating embryos |
Referências
- Lyons, D. A., Guy, A. T., Clarke, J. D. W. Monitoring neural progenitor fate through multiple rounds of division in an intact vertebrate brain. Development. 130, 3427-3436 (2003).
- Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Florio, M., Huttner, W. B. Neural progenitors, neurogenesis and the evolution of the neocortex. Development. 141, 2182-2194 (2014).
- Mcconnell, S. K. Constructing the Cerebral Cortex: Neurogenesis and Fate Determination Review. Neuron. 15, 761-768 (1995).
- Schmidt, R., Strähle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish – from embryo to adult. Neural Development. 8, 3 (2013).
- Chenn, A., Walsh, C. Regulation of Cerebral Cortical Size by Control of Cell Cycle Exit in Neural Precursors. Science. 297 (5580), 365-369 (2002).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and Evolution of the Human Neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
- Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32, 1817-1828 (2013).
- Homem, C. C. F., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nature Reviews Neuroscience. 16 (11), 647-659 (2015).
- Brockway, N. L., et al. Multicolor lineage tracing using in vivo time-lapse imaging reveals coordinated death of clonally related cells in the developing vertebrate brain. Biologia do Desenvolvimento. 453 (2), 130-140 (2019).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genética. 199 (2), 293-306 (2015).
- Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
- Ko, S. K., Chen, X., Yoon, J., Shin, I. Zebrafish as a good vertebrate model for molecular imaging using fluorescent probes. Chemical Society Reviews. 40, 2120 (2011).
- Kesavan, G., Hammer, J., Hans, S., Brand, M. Targeted knock-in of CreERT2 in zebrafish using CRISPR/Cas9. Cell and Tissue Research. 372, 41-50 (2018).
- Cook, Z. T., et al. Combining near-infrared fluorescence with Brainbow to visualize expression of specific genes within a multicolor context. Molecular Biology of the Cell. 30 (4), 491-505 (2019).
- Kuwata, M., Nikaido, M., Hatta, K. Local heat-shock mediated multi-color labeling visualizing behaviors of enteric neural crest cells associated with division and neurogenesis in zebrafish gut. Developmental Dynamics. 248, 437-448 (2019).
- Kinkhabwala, A., et al. A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (3), 1164-1169 (2011).
- Heap, L. A., Goh, C. C., Kassahn, K. S., Scott, E. K. Cerebellar Output in Zebrafish: An Analysis of Spatial Patterns and Topography in Eurydendroid Cell Projections. Frontiers in Neural Circuits. 7, 53 (2013).
- Robles, E., Filosa, A., Baier, H. Precise Lamination of Retinal Axons Generates Multiple Parallel Input Pathways in the Tectum. The Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).
- Dirian, L., et al. Spatial Regionalization and Heterochrony in the Formation of Adult Pallial Neural Stem Cells. Developmental Cell. 30, 123-136 (2014).
- Chen, X. A., et al. Behavioral/Cognitive QRFP and Its Receptors Regulate Locomotor Activity and Sleep in Zebrafish. The Journal of Neuroscience. 36 (6), 1823-1840 (2016).
- Albadri, S., De Santis, F., Di Donato, V., Del Bene, F., Jaenisch, R., Zhang, F., Gage, F. CRISPR/Cas9-Mediated Knockin and Knockout in Zebrafish. Genome Editing in Neurosciences. , 41-49 (2017).
- Furlan, G., et al. Life-Long Neurogenic Activity of Individual Neural Stem Cells and Continuous Growth Establish an Outside-In Architecture in the Teleost Pallium. Current Biology. 27, 3288-3301 (2017).
- Herget, U., Arturo Gutierrez-Triana, J., Salazar Thula, O., Knerr, B., Ryu, S. Single-cell reconstruction of oxytocinergic neurons reveals separate hypophysiotropic and encephalotropic subtypes in larval zebrafish Brainbow-guided morphology of oxytocinergic cells. eNeuro. 4 (1), (2017).
- Halloran, M. C., et al. Laser-targeted gene expression. Development. 127, 1953-1960 (2000).
- Shoji, W., Sato-Maeda, M. Application of heat shock promoter in transgenic zebrafish. Development, Growth & Differentiation. 50, 401-406 (2008).
- Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a Recombinant Retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
- Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104, 473-482 (1988).
- Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-441 (1992).
- Walsh, C., Cepko, C. L. Clonal dispersion in proliferative layers of developing cerebral cortex. Nature. 362 (6421), 632-635 (1993).
- Cai, L., Hayes, N. L., Nowakowski, R. S. Synchrony of Clonal Cell Proliferation and Contiguity of Clonally Related Cells: Production of Mosaicism in the Ventricular Zone of Developing Mouse Neocortex. The Journal of Neuroscience. 17 (6), 2088-2100 (1997).
- Reznikov, K., Acklin, S. E., Van Der Kooy, D. Clonal Heterogeneity in the Early Embryonic Rodent Cortical Germinal Zone and the Separation of Subventricular From Ventricular Zone Lineages. Developmental Dynamics. 210, 328-343 (1997).
- Qian, X., Goderie, S., Shen, Q., Stern, J., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125, 3143-3152 (1998).
- McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic Neural Progenitors Appear to Be Restricted to Regional and Glial Fates before the Onset of Neurogenesis. The Journal of Neuroscience. 21 (17), 6772-6781 (2001).
- Yu, Y. C., Bultje, R. S., Wang, X., Shi, S. H. Specific synapses develop preferentially among sister excitatory neurons in the neocortex. Nature. 458 (7237), 501-504 (2009).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish. , (2002).
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish Breeding in the Laboratory Environment. ILAR Journal. 53 (2), 161-168 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. 25, e1115 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- R Core Team. . R: A language and environment for statistical computing. , (2017).
- Smith, M. R. . Ternary: an R package to generate ternary plots. , (2017).
- Baye, L. M., Link, B. A. Development/Plasticity/Repair Interkinetic Nuclear Migration and the Selection of Neurogenic Cell Divisions during Vertebrate Retinogenesis. The Journal of Neuroscience. 27 (38), 10143-10152 (2007).
- Leung, L., Klopper, A. V., Grill, S. W., Harris, W. A., Norden, C. Apical migration of nuclei during G2 is a prerequisite for all nuclear motion in zebrafish neuroepithelia. Development. 139, 2635 (2012).
- Kerr, J. F. R., Wyllie, A. H., Curriet, A. R. Apoptosis: A Basic Biological Phenomenon with Wide-ranging Implications in Tissue Kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239 (1972).
- Cole, L. K., Ross, L. S. Apoptosis in the Developing Zebrafish Embryo. Biologia do Desenvolvimento. 240, 123-142 (2001).
- Liao, J., He, J., Yan, T., Korzh, V., Gong, Z. A Class of NeuroD-Related Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Expressed in Developing Central Nervous System in Zebrafish. DNA and Cell Biology. 18 (4), 333-344 (1999).
- Trevarrow, B., Marks, D. L., Kimmel, C. B. Organization of hindbrain segments in the zebrafish embryo. Neuron. 4 (5), 669-679 (1990).
- Yabu, T., Todoriki, S., Yamashita, M. Stress-induced apoptosis by heat shock, UV and gamma-ray irradiation in zebrafish embryos detected by increased caspase activity and whole-mount TUNEL staining. Fisheries Science. 67, 333-340 (2001).
