Drosophila Larvalarında Oenositlerin Diseksiyonu ve Lipid Damlacık Boyaması
Summary
Burada, lipit damlacılığa özgü floresan boya olan BODIPY 493/503 kullanılarak Drosophila larvalarında oenositlerin diseksiyon ve lipid damlacık boyama sıyrıklarının diseksiyonu ve lipid damlacık boyaması için ayrıntılı yöntemler sunulmuştur.
Abstract
Lipidler hayvan gelişimi ve fizyolojik homeostaz için gereklidir. Lipid metabolizmasının disregülasyonu obezite ve yağlı karaciğer gibi çeşitli gelişimsel bozukluklar ve hastalıklarla sonuçlanır. Genellikle, lipid damlacıkları saklanır, hangi hücrelerde çok fonksiyonlu lipid depolama organelleri olan. Lipid damlacıkları farklı dokularda ve farklı koşullar altında boyut ve sayı değişir. Bu lipid damlacıkları sıkıca biyogenez ve bozulma nın düzenlenmesi ile kontrol edildiği bildirilmiştir. Drosophila melanogasterolarak , oenosit lipid metabolizması için önemli bir dokudur ve son zamanlarda strese yanıt lipid seferberliği ile ilgili bir insan karaciğer analog olarak tespit edilmiştir. Ancak, oenositlerde lipid damlacık metabolizmasının düzenlenmesinin altında yatan mekanizmalar zor olmaya devam etmektedir. Bu sorunu çözmek için, geliştirme sırasında ve stresli koşullar altında oenositlerde lipid damlacık dinamik değişiklikleri doğrudan görselleştirmek için güvenilir ve hassas bir yöntem geliştirmek son derece önemlidir. Lipofilik BODIPY 493/503 yararlanarak, bir lipid damlacık özgü floresan boya, burada açıklanan diseksiyon ve açlık yanıt olarak Drosophila larvaların oenositler sonraki lipid damlacık boyama için ayrıntılı bir protokoldür. Bu konfokal mikroskopi ile çeşitli koşullar altında lipid damlacık dinamikleri nitel analizi için izin verir. Ayrıca, bu hızlı ve son derece tekrarlanabilir yöntem de oenositler ve diğer dokularda lipid damlacık metabolizması içeren yeni genetik faktörlerin girintisi için genetik ekranlarda kullanılabilir.
Introduction
Lipidler hücre hayatta kalmak için gereklidir. Hücre zarı sistemlerinin ayrılmaz bileşenleri olarak geleneksel rolüne ek olarak, lipidler de enerji kaynağı ve tek tek hayvanların yaşam döngüleri boyunca transdüksiyon sinyal önemli işlevleri oynamak1. Bu nedenle, lipid metabolizması hücrelerde fizyolojik hemostaz korumak için sıkı düzenlemelere uygun olmalıdır. Lipid metabolizmasının disregülasyonunun diyabet ve yağlı karaciğer gibi çeşitli hastalıklara neden olduğu bilinmektedir. Lipid metabolizmasının hayvan sağlığındaki büyük önemine rağmen, lipid metabolizması regülasyonunun altında yatan mekanizmalar büyük ölçüde bilinmemektedir.
Drosophila, profesör Thomas H. Morgan’ın genetik ve diğer temel biyolojik soruları içeren çalışmalarda kullanmaya başlamasından bu yana yıllardır yaygın olarak kullanılmaktadır2. Son birkaç on yıl içinde, ortaya çıkan kanıtlar Drosophila obezite gibi birçok lipid metabolizması ile ilişkili hastalıkların çalışmada mükemmel bir model organizma olduğunugöstermiştir,gibi1,3. Özellikle, Drosophila insanlar ile son derece korunmuş metabolik genleri paylaşır ve lipid metabolizması için benzer ilgili doku / organ ve hücre tipleri sahip.
Örneğin, Drosophilayağ vücut , hangi triasilgliserit depolama sorumludur, insan yağ dokusuna benzer işlevleri. Son zamanlarda, insan karaciğerine fonksiyonel bir analog olduğu bildirilen özel hepatosit benzeri hücreler (yani, oenositler), meyve sinekler yağ asidi ve hidrokarbon metabolizması dahil olduğu gösterilmiştir bir küme4,5. Memeli karaciğerlerinde olduğu gibi, oenositler hem larva hem de erişkin Drosophilalipid damlacık oluşumunu aktive ederek açlık yanıt , oenositlerde lipid damlacık birikimi ile sonuçlanan4,6,7,8. Anatomik olarak, oenositler sıkıca abdominal hemisegment başına yaklaşık altı hücre kümeleri lateral epidermisin bazal iç yüzeyine bağlı, hangi epidermis oenosit kümeleri izole etmek için uygulanamaz hale getirir. Bu nedenle, diseksiyon ve boyama sırasında oenositler epidermis bağlı olmalıdır.
Lipidler lipid damlacıkları şeklinde depolanır, hangi hücrelerde tek katmanlı membranlar ile organeller olan9. Lipid damlacıkları farklı türler arasında hemen hemen tüm hücre tiplerinde var10. Lipid damlacık dinamiği, büyüklüğü ve sayısı da dahil olmak üzere, çevresel strese yanıt olarak değişir. Bu strese yanıt olarak metabolik durumun bir yansıması olarak kabul edilir, yaşlanma ve açlık gibi7,8. Bu nedenle, gelişim sırasında ve stresli koşullar altında oenositlerde lipid damlacık dinamiklerini nitel olarak belirlemek için uygulanabilir ve güvenilir bir yöntem geliştirmek büyük önem taşımaktadır. Özellikle, üçüncü instar larva, oenositler beslenen koşullar altında az veya hiç saptanabilir lipid damlacıkları içeren, ancak beslenme yoksunluğu sonra çok sayıda büyük lipid damlacıkları içerir4. Bu yöntemin etkinliğini doğrulamak için, aç koşullar altında oenositlerde lipid damlacık boyama gerçekleştirmek için önerilmektedir.
Şu anda, birkaç lipophilic boyalar lipid damlacıkları boyama için kullanılabilir, nonfloresan boyalar Sudan Siyah ve Yağ Red O ve floresan boyalar Nil Kırmızı ve BODIPY 493/50311gibi . Sudan Siyah ve Petrol Red O yaygın doku kolesteril esterleri ve triasilgliseroller için kullanılan ve kolayca ışık mikroskopisi ile tespit edilebilir. Ancak, nispeten yüksek arka plan boyama ve nispeten düşük çözünürlük lipid damlacık dinamikleri nitel analizinde uygulamaları için iki sınırlayıcı faktörlerdir. Floresan olmayan boyaların sınırlamalarını aşmak için Nil Kırmızısı ve BODIPY 493/503 lipid damlacık boyamaiçin ideal bir ikame olarak kullanılmaktadır. Bu Nil Kırmızı da bazı unesterified kolesterol tespit edebilirsiniz bildirilmiştir, hangi BODIPY yapar 493/503 hücresel lipid damlacıkları için daha spesifik bir boya, bir ölçüde12,13,14.
Her şeyden önce, oenositlerde lipid damlacıklarının hızlı ve hassas analizi ihtiyacını karşılamak için, bu protokol leke boyası olarak BODIPY 493/503 kullanarak fiksatif tabanlı lipid damlacık özgü boyama uygulanabilir ve son derece tekrarlanabilir bir yöntem sunar. Bu raporda, oenositler kesilir ve BODIPY 493/503 oenositlerde lipid damlacık boyama için kullanılır, hangi lipid damlacıkları konfokal mikroskopi ile tespit edilir. Bu yordamın kolaylığı ve karşılanabilirliği, akış sitometrisi gibi diğer uygulamalarda modifikasyon ve daha fazla kullanım için idealdir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yukarıda özetlenenler arasında, bu protokolde birkaç kritik adım vardır ve yumurtlama süresi bunlardan biridir. Bir lipid-mobilize doku olarak, oenosit beslenme durumuna son dereceduyarlıdır 6,8. Uzun süre yumurtlama süreleri kargalarva ve artan gıda rekabetine neden olabilir, yanlış sonuçlara yol açabilir. Bu protokolde kullanılan 1 saatlik yumurta yumurtlama süresi larvaların beslenme rekabeti olmadan gelişmesini sağlar. Daha uzun yumurtlam…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31671422, 31529004 ve 31601112), 111 Projesi (D18010), Guangdong Perl River Yetenekler Programı Yerel Yenilikçi Araştırma Ekipleri Projesi (2017BT01S15) ve Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (2018M640767).
Materials
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | 50 mL |
| 6 cm Petri dish | Thermo Fisher | 150326 | 6 cm |
| Agar | For fly food | ||
| Aluminum foil | N/A | N/A | Protect smaple from light |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Lipid droplet staining dye |
| Confocal microscope | Leica | Leica TSC SP5 | Confocal imaging |
| Corn syrup | For fly food | ||
| Cornmeal | For fly food | ||
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | 20 × 20 mm, 0.13-0.17 thick |
| Dissection pin | N/A | N/A | |
| Dissection plate | N/A | N/A | |
| Filter paper | N/A | N/A | Diameter: 11 cm |
| Fixation buffer | N/A | N/A | 4% Paraformaldehyde (PFA) in 1xPBS |
| Forcep | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Incubator | Jiangnan | SPX-380 | For fly culture |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | 1.5 ml |
| Microscopy slide | Citoglas | 10127105P-G | |
| Mounting medium | VECTASHIELDAntifade Mounting Medium | H-1000 | Antifade mounting medium |
| Nail polish | PanEra | AAPR419 | Seal the coverslip |
| Paintbrush | N/A | N/A | |
| PBS | N/A | N/A | 1xPBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.4) |
| Rotator | Kylin-Bell Lab Instruments | WH-986 | |
| Scissor | Smartdata Medical | SR81 | Vannas spring scissor |
| Soy flour | For fly food | ||
| Spatula | N/A | N/A | |
| Standard cornmeal food | N/A | N/A | Accoding to Bloomington standard cornmeal food recipe |
| Stereo microscope | Leica | Leica S6E | For tissue dissection |
| Wipe paper | N/A | N/A | |
| Yeast | For fly food | ||
| yw | Kept as lab stock | N/A | Drosophila |
Referências
- Liu, Z., Huang, X. Lipid metabolism in Drosophila: development and disease. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 45 (1), 44-50 (2013).
- Cheng, Y., Chen, D. Fruit fly research in China. Journal of Genetics and Genomics. 45 (11), 583-592 (2018).
- Warr, C. G., Shaw, K. H., Azim, A., Piper, M. D. W., Parsons, L. M. Using mouse and Drosophila models to investigate the mechanistic links between diet, obesity, type II diabetes, and cancer. International Journal of Molecular Science. 19 (12), (2018).
- Gutierrez, E., Wiggins, D., Fielding, B., Gould, A. P. Specialized hepatocyte-like cells regulate Drosophila lipid metabolism. Nature. 445 (7125), 275-280 (2007).
- Makki, R., Cinnamon, E., Gould, A. P. The development and functions of oenocytes. Annual Review of Entomology. 59, 405-425 (2014).
- Chatterjee, D., et al. Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17959-17964 (2014).
- Yan, Y., et al. HDAC6 suppresses age-dependent ectopic fat accumulation by maintaining the proteostasis of PLIN2 in Drosophila. Developmental Cell. 43 (1), 99-111 (2017).
- Yan, Y., et al. HDAC6 regulates lipid droplet turnover in response to nutrient deprivation via p62-mediated selective autophagy. Journal of Genetics and Genomics. 46 (4), 221-229 (2019).
- Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).
- Murphy, D. J. The dynamic roles of intracellular lipid droplets: from archaea to mammals. Protoplasma. 249 (3), 541-585 (2012).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Fowler, S. D., Greenspan, P. Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red O. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 833-836 (1985).
- Gocze, P. M., Freeman, D. A. Factors underlying the variability of lipid droplet fluorescence in MA-10 Leydig tumor cells. Cytometry. 17 (2), 151-158 (1994).
- Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials (Basel). 11 (9), (2018).
- BDSC Standard Cornmeal Medium. Bloomington Drosophila Stock Center Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2019)
- Milon, A., et al. Do estrogens regulate lipid status in testicular steroidogenic Leydig cell?. Acta Histochemica. 121 (5), 611-618 (2019).
- Farmer, B. C., Kluemper, J., Johnson, L. A. Apolipoprotein E4 alters astrocyte fatty acid metabolism and lipid droplet formation. Cells. 8 (2), (2019).
