タンパク質-脂質相互作用を測定するためのマイクロスケール熱泳動の使用
Summary
マイクロスケール熱泳動は、低い材料コストで結合定数を迅速に取得します。標識または標識フリーマイクロスケール熱泳動のいずれかが市販されている;しかしながら、標識フリーの熱泳動は、蛍光標識を用いて行うことができる多様な相互作用測定が可能ではない。当社は、標識熱泳動測定のためのプロトコルを提供しています。
Abstract
脂質とタンパク質との結合親和性を決定する能力は、膜トラフィッキング、シグナル伝達および細胞骨格リモデリングにおけるタンパク質間相互作用を理解する上で不可欠な部分である。このような相互作用を測定するための古典的なツールには、表面プラズモン共鳴(SPR)および等温滴定熱量測定(ITC)が含まれる。強力なツールではありますが、これらのアプローチには挫折があります。ITCは、脂質だけでなく、精製タンパク質を大量に必要とし、コストがかかり、製造が困難な場合があります。さらに、ITCとSPRは非常に時間がかかり、これらの実験を実行するコストを大幅に増加させる可能性があります。これらの制限を回避する方法の1つは、マイクロスケール熱泳動(MST)の比較的新しい技術を使用することです。MSTは、少量のサンプルを使用して、所与の結合事象の飽和曲線を得るために、高速かつ費用対効果が高い。現在、使用可能な MST システムには 2 つのタイプがあります。MSTの1つのタイプは、青色または赤色スペクトルの蛍光色素分子による標識を必要とする。第2のシステムは、UV範囲における芳香族アミノ酸の固有の蛍光に依存する。どちらのシステムも、赤外線レーザーからの局所的な熱誘導に応答して分子の動きを検出します。それぞれのアプローチには長所と短所があります。ラベルフリーMSTは、タグなしの天然タンパク質を使用することができる。しかし、医薬品を含む多くの分析物はUV範囲で蛍光を発し、正確なKD値の決定を妨げる可能性があります。対照的に、標識MSTは、UVとは対照的に可視範囲の測定可能な吸光度を有するリガンドに結合した蛍光標識プローブを利用して、測定可能なペアワイズ相互作用の多様性を可能にし、分析物からのシグナルを妨害する可能性を制限する。
Introduction
マイクロスケール熱泳動は、生化学的に関連するリガンド間の不会合定数(KD)および阻害定数(IC50)を決定する比較的新しい技術です。MSTの大手商業小売業者(NanoTemperなど)は、1)蛍光タグを必要とする標識フリーMSTと、2)各タンパク質に存在する芳香族残基の数に依存するタンパク質の固有の蛍光を使用した標識熱泳動の2つの一般的なMST技術を提供しています1。標識フリー熱泳動の欠点は、ほとんどの場合、タンパク質間相互作用の測定ができないことです。しかし、標識フリー熱泳動2に使用するために、トリプトファンなどの芳香族アミノ酸を含まないタンパク質を操作できる可能性があります。
MSTは、現在利用可能な技術で赤外線レーザーによって開始される微視的な温度場の誘導に応答して粒子の動きを測定します1。MSTは、十分なシグナル分離を生じさせることができる限り、タンパク質間相互作用、タンパク質-脂質相互作用、タンパク質-小分子間相互作用、競合実験、さらには小分子間の相互作用を測定するために使用することができる。さらに、MSTは、リポソームまたはナノディスクのいずれかに埋め込まれた膜 – タンパク質ベースの相互作用の測定を可能にする。標識サーモフォレーシスは、蛍光標識タグの使用を利用して、リガンドと分析物間のシグナルを化学的に制御可能な分離を可能にします。KD値は、低ナノモル濃度でのタンパク質結合を伴う相互作用の熱泳動を使用して得ることができ、ほとんどの場合、等温熱量測定(ITC)3に必要なものよりもはるかに低い濃度のタンパク質である。さらに、MSTには表面プラズモン共鳴(SPR)4に必要な厳密な緩衝要件がなく、標識熱泳動を使用して、遺伝子が挿入された蛍光タグ6を備えた完全に精製されていないタンパク質溶液5から目的のタンパク質の結合定数を測定することもできます。MSTの欠点は、SPR2のようにMSTの速度論的パラメータを容易に取得できないことである。
熱泳動測定は、溶液の局所的な温度差に依存します。この熱は赤外線レーザーから発生させることができる。MST装置は、赤外(IR)ビームに結合された蛍光検出器を有し、IRレーザーが標的とされる点における蛍光分子の局所的な濃度変化から蛍光の変化を拾うことができる。MSTデバイスは、溶液中で熱が発生するのと同じポイントに集束した蛍光検出器に直接結合されたIRターゲットレーザーを利用します。これにより、IRレーザーによって発生する熱の点での分子の枯渇に対応する温度変化の堅牢な検出が可能になります。測定された蛍光は、一般に、温度上昇に応答してIRレーザーに近づくほど減少する。結果として測定される差は、電荷、サイズ、溶媒和エントロピーなどの複数の要因に起因する可能性があります。これらの差は、熱の誘導または毛細血管の高温からより冷たい部分への分子の移動に応答した蛍光の変化として測定される。
キャピラリーに所定の溶液をロードするときは、キャピラリーの両端に空気を残し、キャピラリーを完全にいっぱいにロードしないことが重要です。市販の毛細血管は約10μLの溶液を保持する。溶液がキャピラリーの中心まで操作され、気泡(キャピラリーをロードする前に脱気する可能性がある)がなく、赤外線レーザーが標的とされるキャピラリーの中心から溶液を揺さぶらないようにラックを慎重にロードする限り、5μLの溶液で正確な測定を達成できます。レーザーが溶液と完全に接触しない場合、その結果は、その濃度に対して使用できない3つの出力のうちの1つになる可能性が最も高い:1)蛍光検出なしまたは低い、2)より高い蛍光検出(ギザギザのピークを有する可能性がある)、または3)所定の滴定からの他の値内の蛍光検出が、ギザギザで丸みを帯びていないピークを有する。
標識熱泳動では、200 を超える蛍光ユニットと 2000 未満の蛍光シグナルを持つのが最適です7。MSTデバイスは、0~100の範囲のLED強度を使用し、200以上または2000未満の信号を達成するために選択することができます。あるいは、異なる濃度の標識リガンドを使用して、蛍光シグナルを最適なレベルに修飾することができる。データ分析時に特定のMST測定値を基準としてキャップスキャンを実行することが重要です。キャップスキャンが不十分な場合、後で外れ値と判断される点が生じることがよくあります。キャップスキャンで単一のMST電力を測定する場合、各実行には約30分かかります。商用デバイスでは、MST 電力の変更が可能です。古いソフトウェアバージョンでは、これは0から100まで設定できました。それ以降のバージョンでは、低、中、または高のMSTを選択できます。堅牢なトレースを実現するには、研究者はこれらのそれぞれを試して、特定の相互作用に対して最も堅牢なデータが得られるMST設定を決定する必要があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
DiC8-PAへのVam7-His8結合の決定は、所与の相互作用に対して堅牢なフィッティングKDを提供し、これはPAリポソームに対するVam7-His8の測定されたKDよりもわずかに低い親和性である(未発表)。この差は、膜の欠如に起因する可能性が最も高く、これは一般に、膜特異的脂質結合相互作用に対する親和性の低下をもたらし、したがって、この相互作用に対す…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、米国国立科学財団(MCB 1818310)からRAFへの助成金によって支援されました。この研究は、H. Lee Moffitt Cancer CenterのChemical Biology Core Facility/Protein Crystallography Unit(NIH/NCI:P30-CA076292)によって部分的に支援された。
Materials
| Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye | GE Healthcare | PA23031 | For protein labeleing |
| Graphpad Prsim | Graphpad software | ||
| Monolith NT.115 Capillaries (1000 count) | Nanotemper | MO-K022 | Capillaries for MST |
| Monolith NT.115 machine | Nanotemper | University equipment | |
| NTA-Atto 647 N | Sigma | 2175 | label for His tags |
| Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8) | Echelon | P-3008 | Lipid for binding experiments |
Referências
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