Микромасштабный термофорез быстро получает константы связывания при низких материальных затратах. Микромасштабный термофорез без маркировки или этикетки коммерчески доступен; однако термофорез без меток не способен к разнообразию измерений взаимодействия, которые могут быть выполнены с использованием флуоресцентных этикеток. Мы предоставляем протокол для маркировки измерений термофореза.
Способность определять сродство связывания липидов с белками является неотъемлемой частью понимания белково-липидных взаимодействий в мембранном трафике, сигнальной трансдукции и цитоскелетном ремоделировании. Классические инструменты для измерения таких взаимодействий включают поверхностный плазмонный резонанс (SPR) и изотермическую титрационную калориметрию (ITC). Несмотря на то, что эти подходы являются мощными инструментами, они имеют недостатки. ITC требует большого количества очищенного белка, а также липидов, которые могут быть дорогостоящими и трудными в производстве. Кроме того, ЦМТ, а также ОСП отнимают очень много времени, что может значительно увеличить стоимость проведения этих экспериментов. Одним из способов обойти эти ограничения является использование относительно новой техники микромасштабного термофореза (MST). MST является быстрым и экономически эффективным с использованием небольших количеств образца для получения кривой насыщения для данного события связывания. В настоящее время существует два типа систем MST. Один тип MST требует маркировки флуорофором в синем или красном спектре. Вторая система опирается на внутреннюю флуоресценцию ароматических аминокислот в УФ-диапазоне. Обе системы обнаруживают движение молекул в ответ на локализованную индукцию тепла от инфракрасного лазера. Каждый подход имеет свои преимущества и недостатки. MST без меток может использовать непомеченные нативные белки; однако многие аналиты, включая фармацевтические препараты, флуоресцируют в УФ-диапазоне, что может мешать определению точных значений КД. Для сравнения, меченый MST обеспечивает большее разнообразие измеримых парных взаимодействий с использованием флуоресцентно меченых зондов, прикрепленных к лигандам с измеримыми поглощениями в видимом диапазоне, в отличие от ультрафиолета, ограничивая потенциал для мешающих сигналов от аналитов.
Микромасштабный термофорез является относительно новым методом определения констант диссоциации (KD), а также констант ингибирования (IC50) между биохимически значимыми лигандами. Ведущий коммерческий ритейлер MST (например, NanoTemper) предлагает две популярные технологии MST: 1) MST без маркировки, требующей флуоресцентной метки, и 2) меченый термофорез с использованием присущей флуоресценции белков в зависимости от количества ароматических остатков, присутствующих в каждом белке1. Недостатком термофореза без меток является то, что в большинстве случаев он не позволяет измерить белково-белковые взаимодействия. Тем не менее, может быть возможно спроектировать белки без ароматических аминокислот, таких как триптофан, для использования в термофорезе без меток2.
MST измеряет движение частиц в ответ на индукцию микроскопических температурных полей, инициированных инфракрасным лазером в доступных в настоящее время технологиях1. MST может быть использован для измерения белково-белковых взаимодействий, белково-липидных взаимодействий, белково-малых молекул, экспериментов с конкуренцией и даже взаимодействий между малыми молекулами, если можно произвести достаточное разделение сигналов. Кроме того, MST позволяет измерять взаимодействия на основе мембранных белков, встроенные либо в липосомы, либо в нанодиски. Меченый термофорез использует преимущества использования флуоресцентно меченых меток, позволяющих химически контролируемое разделение сигнала между лигандом и анализируемым веществом. Значения KD могут быть получены с помощью термофореза для взаимодействий, включающих связывание белка при низких наномолярных концентрациях, что в большинстве случаев является гораздо более низкой концентрацией белка, чем то, что требуется для изотермической калориметрии (ITC)3. Кроме того, MST не имеет строгих требований к буферизации, как это требуется для поверхностного плазмонного резонанса (SPR)4, и меченый термофорез может даже использоваться для измерения констант связывания интересующих белков из неполно очищенных белковых растворов5 с генетически вставленными флуоресцентными метками6. Недостатком MST является то, что кинетические параметры не могут быть легко получены для MST, как в SPR2.
Измерения термофореза зависят от локальной разницы температур раствора. Это тепло может генерироваться инфракрасным лазером. Устройство MST имеет флуоресцентный детектор, соединенный с инфракрасным (ИК) лучом, и может улавливать изменения флуоресценции от локальных изменений концентрации флуоресцентных молекул в точке, куда нацелен ИК-лазер. Устройство MST использует ИК-направленный лазер, связанный непосредственно с флуоресцентным детектором, сфокусированным в той же точке, в которой тепло генерируется в растворе. Это позволяет надежно обнаруживать изменения температуры, соответствующие истощению молекул в точке тепла, генерируемого ИК-лазером. Измеренная флуоресценция обычно уменьшается ближе к ИК-лазеру в ответ на повышение температуры. Различия, измеренные в результате, могут быть обусловлены несколькими факторами, включая заряд, размер или энтропию сольватации. Эти различия измеряются как изменения флуоресценции в ответ на индукцию тепла или движение молекул из горячих в более холодные части капилляра.
При загрузке капилляра данным раствором важно оставлять воздух на обоих концах капилляра и не нагружать капилляр полностью. Коммерческий капилляр содержит около 10 мкл раствора. Можно достичь точных измерений с 5 мкл раствора до тех пор, пока раствор манипулируется к центру капилляра, нет пузырьков воздуха (потенциально дегаз перед загрузкой капилляра), и кто-то осторожно загружает стойку, чтобы не толкать раствор из центра капилляра, куда нацелен инфракрасный лазер. Если лазер не вступает в полный контакт с раствором, результатом, скорее всего, будет один из трех непригодных для использования выходов для этой концентрации: 1) обнаружение отсутствия или низкой флуоресценции, 2) обнаружение более высокой флуоресценции (потенциально с зубчатым пиком) или 3) обнаружение флуоресценции в пределах других значений от заданного титрования, но с зубчатым и неокругленным пиком.
Для маркированного термофореза оптимально иметь флуоресцентный сигнал выше 200 и ниже 2000 единиц флуоресценции7. Устройство MST использует диапазон интенсивности светодиодов от 0 до 100, которые могут быть выбраны для достижения сигнала выше 200 или ниже 2000. Альтернативно, можно использовать различные концентрации меченого лиганда для модификации флуоресцентного сигнала до оптимального уровня. При анализе данных важно запускать сканирование колпачка с заданным измерением MST в качестве эталона, так как сканирование плохого колпачка часто может привести к точке, которая впоследствии может быть определена как выброс. Каждый запуск должен занимать около 30 минут при измерении одной мощности MST с помощью сканирования колпачка. Коммерческие устройства позволяют изменять мощность MST. В старых версиях программного обеспечения это может быть установлено от 0 до 100; а в более поздних версиях можно выбрать низкий, средний или высокий MST. Чтобы достичь надежных следов, исследователю может потребоваться попробовать каждый из них и решить, какая настройка MST приводит к наиболее надежным данным для данного взаимодействия.
Определение привязки Vam7-His8 к DiC8-PA обеспечило надежный установленный KD для данного взаимодействия, который несколько ниже сродства, чем измеренный KD липосом Vam7-His8 к PA (неопубликованный). Это различие, скорее всего, связано с отсутствием мембраны, что обычно…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано грантом Национального научного фонда (MCB 1818310) RAF. Эта работа была частично поддержана Центром химической биологии ядра / Отделом кристаллографии белка в Онкологическом центре Х. Ли Моффитта (NIH / NCI: P30-CA076292).
Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye | GE Healthcare | PA23031 | For protein labeleing |
Graphpad Prsim | Graphpad software | ||
Monolith NT.115 Capillaries (1000 count) | Nanotemper | MO-K022 | Capillaries for MST |
Monolith NT.115 machine | Nanotemper | University equipment | |
NTA-Atto 647 N | Sigma | 2175 | label for His tags |
Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8) | Echelon | P-3008 | Lipid for binding experiments |