Uso de Termoforese microescala para medir interações proteína-lipídicas

Resumo

A termoforese de microescala obtém constantes de ligação rapidamente a baixo custo de material. A termoforese de microescala rotulada ou sem rótulo está comercialmente disponível; no entanto, a termoforese livre de rótulos não é capaz da diversidade de medidas de interação que podem ser realizadas usando rótulos fluorescentes. Fornecemos um protocolo para medições de termoforese rotuladas.

Resumo

A capacidade de determinar a afinidade vinculante dos lipídios às proteínas é uma parte essencial da compreensão das interações proteína-lipídicas no tráfico de membranas, transdução de sinais e remodelagem citoesquelética. Ferramentas clássicas para medir tais interações incluem ressonância de plasmon superficial (SPR) e calorimetria de titulação isotermal (ITC). Embora ferramentas poderosas, essas abordagens têm contratempos. O ITC requer grandes quantidades de proteína purificada, bem como lipídios, que podem ser caros e difíceis de produzir. Além disso, o ITC e o SPR são muito demorados, o que poderia agregar significativamente ao custo de realizar esses experimentos. Uma maneira de contornar essas restrições é usar a técnica relativamente nova de termoforese de microescala (MST). O MST é rápido e econômico usando pequenas quantidades de amostra para obter uma curva de saturação para um determinado evento de vinculação. Atualmente existem dois tipos de sistemas MST disponíveis. Um tipo de MST requer rotulagem com um fluoróforo no espectro azul ou vermelho. O segundo sistema conta com a fluorescência intrínseca de aminoácidos aromáticos na faixa UV. Ambos os sistemas detectam o movimento das moléculas em resposta à indução localizada de calor de um laser infravermelho. Cada abordagem tem suas vantagens e desvantagens. O MST sem rótulos pode usar proteínas nativas não cometas; no entanto, muitos analitos, incluindo farmacêuticos, fluoresce na faixa UV, que podem interferir com a determinação de valores de KD precisos. Em comparação, o MST rotulado permite uma maior diversidade de interações paridas mensuráveis utilizando sondas fluorescentes rotuladas ligadas a ligantes com absorções mensuráveis na faixa visível em oposição à UV, limitando o potencial de interferência de sinais de analitos.

Introdução

A termoforese de microescala é uma técnica relativamente nova na determinação das constantes de desassociação (KD), bem como as constantes de inibição (_IC50) entre ligantes bioquimicamente relevantes. O principal varejista comercial para MST (por exemplo, NanoTemper) oferece duas tecnologias populares de MST: 1) Rotular MST livre exigindo uma marca fluorescente, e 2) rotulada termoforese usando a fluorescência inerente de proteínas dependentes do número de resíduos aromáticos presentes em cada ^proteína1. Uma desvantagem da termoforese sem rótulo é que, na maioria dos casos, não permite a medição de intera....

Protocolo

1. Preparação de materiais

1. Preparar soro fisco tampão de fosfato (PBS): 137 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM _NaH2PO4 e 2 mM _KH2PO4, pH 7.41.
2. Prepare o corante NTA-Atto 647 N. Diluir o estoque NTA-Atto 647 N corante para 100 nM de uma solução DMSO 100% em PBS sem Interpol.
3. Express Vam7-His8 – Proteína como proteína de fusão em E. coli e purificar usando Ni-NTA e exclusão de tamanho cromatografia8.
4. Titular o analito no buffer PBS. Se o analito estiver em um buffer diferente, o MST rotulado não é particularmente sensível a pequenas difere....

Resultados

Esta é uma saída amostral usando a análise de afinidade. O MST rotulado foi usado para determinar a constante de ligação do Vam7-His8 ao dioctanoyl solúvel (DiC8) PA de um de seus substratos ^naturais9. A Figura 1 apresenta os traços termoforéticos de um ensaio de uma titulação de 1:1 de DiC8 PA a partir de 500 μM contra 50 nM de Vam7-His8. Fluorescência inicial (tempo antes do laser infravermelho ligado), Tjump (tempo inicialmente após o laser infravermelho ligado) e .......

Discussão

A determinação de Vam7-His8binding para DiC8-PA forneceu um _KD robusto para a interação dada, que é um pouco menor do que o KD medido de Vam7-His8 para lipossomos pa (inédito). Essa diferença é mais provável devido à falta de uma membrana, o que geralmente resulta em menor afinidade para interações de ligação lipídica específica da membrana e, portanto, demonstra o papel do andaime de membrana liposso para esta ^{interação11}.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cy5 Maleimide Corante Mono-Reativo	GE Healthcare	PA23031	Para rotulagem de proteínas
Graphpad Prsim	Software
Monolith NT.115 Capilares (1000 contagens)	Nanotemper	MO-K022	Capilares para MST
Monolith NT.115 máquina	Nanotemper		University equipment
NTA-Atto 647	N Sigma	2175	rótulo para His tags
Fosfatidilinositol 3-fosfato diC8 (PI(3)P diC8)	Echelon	P-3008	Lipídio para experimentos de ligação

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