Denne protokol beskriver en omfattende hæmorikompatibilitet evaluering af blod-kontakt enheder ved hjælp af laser-cut neurovaskulære implantater. En flow loop model med frisk, heparinized humant blod anvendes til at efterligne blodgennemstrømningen. Efter perfusion analyseres forskellige hæmatologiske markører og sammenlignes med de værdier, der opnås umiddelbart efter blodtapning for hæmorikompatibilitetsevaluering af de testede enheder.
Den stigende brug af medicinsk udstyr (f.eks. vaskulære transplantater, stenter og hjertekatetre) til midlertidige eller permanente formål, der forbliver i kroppens kredsløbssystem, kræver en pålidelig og multiparametrisk tilgang, der evaluerer de mulige hæmatologiske komplikationer forårsaget af disse anordninger (dvs. aktivering og destruktion af blodkomponenter). Omfattende in vitro hæmogomikompatibilitet test af blod-kontakte implantater er det første skridt i retning af en vellykket in vivo gennemførelse. Derfor er omfattende analyse ifølge Den Internationale Standardiseringsorganisation 10993-4 (ISO 10993-4) obligatorisk før klinisk anvendelse. Den præsenterede flow loop beskriver en følsom model til at analysere den hæmostatiske ydeevne af stents (i dette tilfælde, neurovaskulære) og afsløre bivirkninger. Brugen af frisk humant fuldblod og blid blodprøvetagning er afgørende for at undgå præaktivering af blod. Blodet gennembruges gennem en hepariniseret slange, der indeholder prøveemnet, ved hjælp af en peristaltisk pumpe med en hastighed på 150 ml/min. ved 37 °C i 60 min. Før og efter perfusion, hæmatologiske markører (dvs. antallet af blodlegemer, hæmoglobin, hæmatokrit og plasmatiske markører), der angiver aktivering af leukocytter (polymorfocyon [PMN]-elastase), blodplader (β-tromboglobulin [β-TG]), koagulationssystemet (thombin-antithrombin III [TAT]) og komplementkaskade (SC5b-9) analyseres. Afslutningsvis præsenterer vi en vigtig og pålidelig model for omfattende hæmorikompatibilitetstest af stenter og andre blodkontaktenheder forud for klinisk anvendelse.
In vivo-anvendelsen af implantater og biomaterialer, som interagerer med humant blod, kræver intens præklinisk testning med fokus på undersøgelse af forskellige markører for det hæmostatiske system. Den Internationale Standardiseringsorganisation 10993-4 (ISO 10993-4) specificerer de centrale principper for vurdering af blodkontakt (dvs. stents og vaskulære transplantater) og tager hensyn til udstyrets design, kliniske nytteværdi og nødvendige materialer1.
Humant blod er en væske, der indeholder forskellige plasmaproteiner og -celler, herunder leukocytter (hvide blodlegemer [WBCs]), erythrocytter (røde blodlegemer [RBC]), og blodplader, som udfører komplekse funktioner i den menneskelige krop2. Den direkte kontakt mellem fremmede materialer og blod kan forårsage bivirkninger, såsom aktivering af immunsystemet eller koagulationssystemet, hvilket kan føre til betændelse eller trombotiske komplikationer og alvorlige problemer efter implantation3,4,5. Derfor giver in vitro hæmogomkompatibilitetsvalidering en mulighed før implantation for at opdage og udelukke hematologiske komplikationer , der kan fremkaldes ved blods kontakt med en fremmed overflade6.
Den præsenterede flow loop model blev etableret for at vurdere hæmokompatibilitet af neurovaskulære stents og lignende enheder ved at anvende en strømningshastighed på 150 ml / min i slanger (diameter på 3,2 mm) til at efterligne cerebral flow betingelser og arterie diametre2,7. Ud over behovet for en optimal in vitro-model er blodkilden en vigtig faktor for at opnå pålidelige og uændrede resultater, når man analyserer hæmokompatibilitet af et biomateriale8. Det indsamlede blod skal anvendes umiddelbart efter prøveudtagningen for at forhindre ændringer forårsaget af langvarig opbevaring. Generelt bør der udføres en skånsom tapning af blod uden stase ved hjælp af en 21 G nål for at minimere præaktiveringen af blodplader og koagulationskaskade under blodtegning. Endvidere omfatter donorudelukkelseskriterier dem, der ryger, er gravide, er i dårlig sundhedstilstand eller har taget p-piller eller smertestillende midler i løbet af de foregående 14 dage.
Denne undersøgelse beskriver en in vitro model for den omfattende hæmokompatibilitet test af stent implantater under flow betingelser. Når man sammenligner ubestrøget med fibrin-heparin-belagte stents, resultaterne af den omfattende hæmokompatibilitet test afspejler forbedret hæmokompatibilitet af fibrin-heparin-belagte stents9. I modsætning hertil fremkalder de ubestrøget stents aktivering af koagulationskaskade, som det fremgår af en stigning i thombin-antithrombin III (TAT) koncentrationer og tab af blodpladenumre på grund af vedhæftning af blodplader til stent overflade. Samlet set anbefales det at integrere denne hæm/kompatibilitetsmodel som en præklinisk test for at påvise eventuelle bivirkninger på det hæmostatiske system, der er forårsaget af enheden.
Den præsenterede protokol beskriver en omfattende og pålidelig metode til hæmofikompatibilitetstest af blodkontaktende implantater i overensstemmelse med ISO 10993-4 i en forskydningsflowmodel, der efterligner blodgennemstrømningen hos mennesker. Denne undersøgelse er baseret på test af laser-cut neurovaskulære implantater, men kan udføres med en række prøver. Resultaterne viser, at denne metode muliggør en bred analyse af forskellige parametre såsom blodcelletal, forekomsten af flere hæmokompatibilitetsmark…
The authors have nothing to disclose.
For udførelsen af scanning elektron mikroskopi, takker vi Ernst Schweizer fra den del af medicinske materialer videnskab og teknologi på universitetshospitalet Tuebingen. Forskningen blev støttet af Undervisnings-, Ungdoms- og Sportsministeriet i CR under Det Nationale Bæredygtighedsprogram II (Projekt BIOCEV-FAR LQ1604) og af Det Tjekkiske Videnskabsinstituts projekt nr.
aqua ad iniectabilia | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1088813 | |
beta-TG ELISA | Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany | 00950 | |
Centrifuge Rotana 460 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | – | |
Citrat monovettes (1.4 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,68,001 | |
CTAD monovettes (2.7 mL) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 367562 | |
EDTA monovettes (1.2 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,62,001 | |
Ethanol p.A. (1000 mL) | AppliChem, Darmstadt, Germany | 1,31,08,61,611 | |
Glutaraldehyde (25 % in water) | SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany | 23114.01 | |
Heparin coating for tubes | Ension, Pittsburgh, USA | – | |
Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL) | LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany | PZN 15261203 | |
Multiplate Reader Mithras LB 940 | Berthold, Bad Wildbad, Germany | – | |
NaCl 0,9% | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1312813 | |
Neutral monovettes (9 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 2,10,63,001 | |
PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
Peristaltic pump ISM444B | Cole Parmer, Wertheim, Germany | 3475 | |
Pipette (100 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3124000075 | |
Pipette (1000 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3123000063 | |
Plastic container (100 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 7,55,62,300 | |
PMN-Elastase ELISA | Demeditec Diagnostics, Kiel Germany | DEH3311 | |
Polyvinyl chloride tube | Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France | – | |
Reaction Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 30123328 | |
neurovascular laser-cut implants | Acandis GmbH, Pforzheim | 01-0011x | |
SC5b-9 ELISA | TECOmedical, Buende, Germany | A029 | |
Scanning electron microscope | Cambridge Instruments, Cambridge, UK | – | |
Sealing tape (96 well plate) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15036 | |
Syringe 10/12 mL Norm-Ject | Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany | 10080010 | |
TAT micro kit | Siemens Healthcare, Marburg, Germany | OWMG15 | |
Waterbath Type 1083 | Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel, Germany | – |