Hemocompatibiliteittesten van bloedcontactimplantaten in een Flow Loop-model dat menselijke bloedstroom nabootst
Summary
Dit protocol beschrijft een uitgebreide hemocompatibiliteitsevaluatie van bloedcontactapparatuur met behulp van lasergesneden neurovasculaire implantaten. Een flow loop model met vers, gehepariniseerd menselijk bloed wordt toegepast om de bloedstroom na te bootsen. Na perfusie worden verschillende hematologische markers geanalyseerd en vergeleken met de waarden die direct na de bloedafname zijn opgedaan voor hemocompatibiliteitsevaluatie van de geteste apparaten.
Abstract
Het toenemende gebruik van medische hulpmiddelen (bijvoorbeeld vaattransplantaties, stents en hartkatheters) voor tijdelijke of permanente doeleinden die in de bloedsomloop van het lichaam achterblijven, vereist een betrouwbare en multiparametrische aanpak die de mogelijke hematologische complicaties door deze apparaten evalueert (d.w.z. activering en vernietiging van bloedbestanddelen). Uitgebreide in vitro hemocompatibiliteitstests van bloedcontactimplantaten is de eerste stap naar een succesvolle implementatie in vivo. Daarom is uitgebreide analyse volgens de International Organization for Standardization 10993-4 (ISO 10993-4) verplicht voorafgaand aan de klinische toepassing. De gepresenteerde stroomlus beschrijft een gevoelig model om de hemostatische prestaties van stents te analyseren (in dit geval neurovasculair) en bijwerkingen te onthullen. Het gebruik van vers menselijk volbloed en zachte bloedafname zijn essentieel om de preactivering van bloed te voorkomen. Het bloed wordt geperfundeerd door een gehepariniseerde slang die het testmonster bevat met behulp van een peristaltische pomp met een snelheid van 150 mL/min bij 37 °C gedurende 60 min. Voor en na perfusie, hematologische markers (d.w.z. het aantal bloedcellen, hemoglobine, hematocriet en plasmatische markers) die de activering van leukocyten (polymorfoomaat [PMN]-elastase), bloedplaatjes (β-tromboglobine [β-TG]), het stollingssysteem (thombin-antithrombine III [TAT]) en de complementcascade (SC5b-9) worden geanalyseerd. Tot slot presenteren we een essentieel en betrouwbaar model voor uitgebreide hemocompatibiliteitstests van stents en andere bloedcontactapparatuur voorafgaand aan de klinische toepassing.
Introduction
De in vivo toepassing van implantaten en biomaterialen, die interageren met menselijk bloed, vereist intensieve preklinische tests gericht op het onderzoek van verschillende markers van het hemostatisch systeem. De Internationale Organisatie voor Normalisatie 10993-4 (ISO 10993-4) specificeert de centrale principes voor de evaluatie van bloedcontactapparatuur (d.w.z. stents en vasculaire grafts) en beschouwt het apparaatontwerp, klinisch nut en benodigde materialen1.
Menselijk bloed is een vloeistof die verschillende plasma-eiwitten en cellen bevat, waaronder leukocyten (witte bloedcellen [WBC’s]), erytrocyten (rode bloedcellen [RBCs]), en bloedplaatjes, die complexe functies in het menselijk lichaam uitvoeren2. Het directe contact van vreemde materialen met bloed kan nadelige effecten veroorzaken, zoals activering van het immuunsysteem of stollingssysteem, wat kan leiden tot ontsteking of trombotische complicaties en ernstige problemen na implantatie3,4,5. Daarom biedt in vitro hemocompatibiliteitsvalidatie een mogelijkheid voorafgaand aan de implantatie om eventuele hematologische complicaties op te sporen en uit te sluiten die kunnen worden veroorzaakt bij contact van het bloed met een vreemd oppervlak6.
Het gepresenteerde stroomlusmodel werd opgericht om de hemocompatibiliteit van neurovasculaire stents en soortgelijke apparaten te beoordelen door een stroomsnelheid van 150 mL/min in buizen (diameter van 3,2 mm) aan te passen om cerebrale stroomomstandigheden en slagaderdiameters na te bootsen2,7. Naast de behoefte aan een optimaal in vitro model, is de bron van bloed een belangrijke factor bij het verkrijgen van betrouwbare en ongewijzigde resultaten bij het analyseren van hemocompatibiliteit van een biomateriaal8. Het verzamelde bloed moet onmiddellijk na de bemonstering worden gebruikt om veranderingen veroorzaakt door langdurige opslag te voorkomen. In het algemeen moet een zachte verzameling bloed zonder stasis met behulp van een 21 G naald worden uitgevoerd om de vooractivering van bloedplaatjes en de stollingscascade tijdens het tekenen van bloed te minimaliseren. Bovendien, donor uitsluiting criteria omvatten degenen die roken, zwanger zijn, zijn in een slechte staat van gezondheid, of hebben orale anticonceptiva of pijnstillers genomen tijdens de voorgaande 14 dagen.
Deze studie beschrijft een in vitro model voor de uitgebreide hemocompatibiliteittesten van stentimplantaten onder stromingsomstandigheden. Bij het vergelijken van ongecoate stents met fibrine-heparine, weerspiegelen de resultaten van de uitgebreide hemocompatibiliteitstests een verbeterde hemocompatibiliteit van de met fibrine-heparine gecoate stents9. Daarentegen veroorzaken de ongecoate stents activering van de stollingscascade, zoals blijkt uit een toename van thombin-antitrombine III (TAT) concentraties en verlies van bloedplaatjesnummers als gevolg van de hechting van bloedplaatjes aan het stentoppervlak. Over het algemeen wordt aanbevolen om dit hemocompatibiliteitsmodel als preklinische test te integreren om eventuele nadelige effecten op het hemostatische systeem te detecteren die door het apparaat worden veroorzaakt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het gepresenteerde protocol beschrijft een uitgebreide en betrouwbare methode voor het hemocompatibiliteitsonderzoek van bloedcontactimplantaten overeenkomstig ISO 10993-4 in een schuifstroommodel dat de menselijke bloedstroom imiteert. Deze studie is gebaseerd op het testen van lasergesneden neurovasculaire implantaten, maar kan worden uitgevoerd met een verscheidenheid aan monsters. De resultaten tonen aan dat deze methode de brede analyse van verschillende parameters mogelijk maakt, zoals het aantal bloedcellen, preva…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Voor de uitvoering van scanning elektronenmicroscopie bedanken we Ernst Schweizer van de sectie Medical Materials Science and Technology van het Universitair Ziekenhuis Tuebingen. Het onderzoek werd ondersteund door het Ministerie van Onderwijs, Jeugd en Sport van de CR binnen National Sustainability Program II (Project BIOCEV-FAR LQ1604) en door Czech Science Foundation project Nr. 18-01163S.
Materials
| aqua ad iniectabilia | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1088813 | |
| beta-TG ELISA | Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany | 00950 | |
| Centrifuge Rotana 460 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | – | |
| Citrat monovettes (1.4 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,68,001 | |
| CTAD monovettes (2.7 mL) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 367562 | |
| EDTA monovettes (1.2 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,62,001 | |
| Ethanol p.A. (1000 mL) | AppliChem, Darmstadt, Germany | 1,31,08,61,611 | |
| Glutaraldehyde (25 % in water) | SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany | 23114.01 | |
| Heparin coating for tubes | Ension, Pittsburgh, USA | – | |
| Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL) | LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany | PZN 15261203 | |
| Multiplate Reader Mithras LB 940 | Berthold, Bad Wildbad, Germany | – | |
| NaCl 0,9% | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1312813 | |
| Neutral monovettes (9 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 2,10,63,001 | |
| PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| Peristaltic pump ISM444B | Cole Parmer, Wertheim, Germany | 3475 | |
| Pipette (100 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3124000075 | |
| Pipette (1000 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3123000063 | |
| Plastic container (100 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 7,55,62,300 | |
| PMN-Elastase ELISA | Demeditec Diagnostics, Kiel Germany | DEH3311 | |
| Polyvinyl chloride tube | Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France | – | |
| Reaction Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 30123328 | |
| neurovascular laser-cut implants | Acandis GmbH, Pforzheim | 01-0011x | |
| SC5b-9 ELISA | TECOmedical, Buende, Germany | A029 | |
| Scanning electron microscope | Cambridge Instruments, Cambridge, UK | – | |
| Sealing tape (96 well plate) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15036 | |
| Syringe 10/12 mL Norm-Ject | Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany | 10080010 | |
| TAT micro kit | Siemens Healthcare, Marburg, Germany | OWMG15 | |
| Waterbath Type 1083 | Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel, Germany | – |
Referências
- ISO. . Biological evaluation of medical devices. , (2002).
- Weber, M., et al. Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 99 (2018).
- Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine (Lond). 11 (3), 269-287 (2016).
- Cattaneo, G., et al. In vitro investigation of chemical properties and biocompatibility of neurovascular braided implants. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 30 (6), 67 (2019).
- Stang, K., et al. Hemocompatibility testing according to ISO 10993-4: discrimination between pyrogen- and device-induced hemostatic activation. Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 42, 422-428 (2014).
- van Oeveren, W. Obstacles in haemocompatibility testing. Scientifica (Cairo). , 392584 (2013).
- Engels, G. E., Blok, S. L., van Oeveren, W. In vitro blood flow model with physiological wall shear stress for hemocompatibility testing-An example of coronary stent testing. Biointerphases. 11 (3), 031004 (2016).
- Blok, S. L., Engels, G. E., van Oeveren, W. In vitro hemocompatibility testing: The importance of fresh blood. Biointerphases. 11 (2), 029802 (2016).
- Kaplan, O., et al. Low-thrombogenic fibrin-heparin coating promotes in vitro endothelialization. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2995-3005 (2017).
- . SEM Imaging of Biological Samples Available from: https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples (2019)
- Mohan, C. C., Chennazhi, K. P., Menon, D. In vitro hemocompatibility and vascular endothelial cell functionality on titania nanostructures under static and dynamic conditions for improved coronary stenting applications. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9568-9577 (2013).
- Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces. The Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 66 (1), 379-390 (2003).
- Sanak, M., Jakieła, B., Węgrzyn, W. Assessment of hemocompatibility of materials with arterial blood flow by platelet functional tests. Bulletin of the Polish Academy of Sciences: Technical Sciences. 58 (2), 317-322 (2010).
- Krajewski, S., et al. Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).
- Podias, A., Groth, T., Missirlis, Y. The effect of shear rate on the adhesion/activation of human platelets in flow through a closed-loop polymeric tubular system. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 6 (5), 399-410 (1994).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers-a practical guide. Platelets. 23 (3), 229-242 (2012).
- Müller, M., Krolitzki, B., Glasmacher, B. Dynamic in vitro hemocompatibility testing-improving the signal to noise ratio. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 57, 549-552 (2012).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around “air bubbles” in blood after venous air embolism. International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).
- Miller, R., et al. Characterisation of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 131 (1), 225-230 (1998).
- van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. International Journal of Biomaterials. , 673163 (2012).
- Krajewski, S., et al. Preclinical evaluation of the thrombogenicity and endothelialization of bare metal and surface-coated neurovascular stents. AJNR American Journal of Neuroradiology. 36 (1), 133-139 (2015).
- Monnink, S. H., et al. Silicon-carbide coated coronary stents have low platelet and leukocyte adhesion during platelet activation. Journal of Investigative Medicine. 47 (6), 304-310 (1999).
- Amoroso, G., van Boven, A. J., Volkers, C., Crijns, H. J., van Oeveren, W. Multilink stent promotes less platelet and leukocyte adhesion than a traditional stainless steel stent: an in vitro experimental study. Journal of Investigative Medicine. 49 (3), 265-272 (2001).
- Mulvihill, J., Crost, T., Renaux, J. L., Cazenave, J. P. Evaluation of haemodialysis membrane biocompatibility by parallel assessment in an ex vivo model in healthy volunteers. Nephrology Dialysis Transplantation. 12 (9), 1968-1973 (1997).
- Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium. Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).
