Summary

Гемосовместимость Тестирование кровоконтактных имплантатов в модели петли потока, имитирующей поток крови человека

Published: March 05, 2020
doi:

Summary

Этот протокол описывает комплексную оценку гемосовместимости кроветковых устройств с использованием нейрососудистых имплантатов с лазерной резкой. Модель петли потока со свежей, гепаринной человеческой кровью применяется для имитации кровотока. После перфузии анализируются различные гематологические маркеры и сравниваются с значениями, полученными сразу после сбора крови для оценки гемосовместимости исследуемых устройств.

Abstract

Растущее использование медицинских приборов (например, сосудистых трансплантатов, стентов и сердечных катетеров) для временных или постоянных целей, остающихся в системе кровообращения организма, требует надежного и многопараметрического подхода, который оценивает возможные гематологические осложнения, вызванные этими устройствами (т.е. активация и разрушение компонентов крови). Всеобъемлющее тестирование на гемосовместимость в пробирке имплантатов, контактирующих с кровью, является первым шагом на пути к успешной реализации in vivo. Поэтому обширный анализ в соответствии с Международной организацией по стандартизации 10993-4 (ISO 10993-4) является обязательным до клинического применения. Представленный цикл потока описывает чувствительную модель для анализа гемостатической производительности стентов (в данном случае, нервно-сосудистых) и выявления побочных эффектов. Использование свежей человеческой цельной крови и нежный отбор проб крови имеют важное значение, чтобы избежать преактивации крови. Кровь пронизана гепариной трубкой, содержащей испытательный образец, используя перистальтический насос со скоростью 150 мл/мин при 37 градусах По цельсию в течение 60 мин. До и после перфузии гематологические маркеры (т.е., количество клеток крови, гемоглобин, гематокрит и плазматические маркеры), указывающие на активацию лейкоцитов (полиморфоядерная «ПМН-эластаза»), тромбоцитов (з-тромболобулин, ц-ТГ), системы коагуляции (томбин-антитромбин III «Тат» и В заключение мы представляем важную и надежную модель для обширного гемосовместимости тестирования стентов и других кровоконтактных устройств до клинического применения.

Introduction

Применение in vivo имплантатов и биоматериалов, которые взаимодействуют с человеческой кровью, требует интенсивного доклинического тестирования, фокусирующегося на исследовании различных маркеров гемостатической системы. Международная организация по стандартизации 10993-4 (ISO 10993-4) определяет основные принципы оценки кроветворных устройств (т.е. стентов и сосудистых трансплантатов) и рассматривает конструкцию устройства, клиническую полезность и необходимые материалы1.

Человеческая кровь представляет собой жидкость, которая содержит различные белки плазмы и клетки, в том числе лейкоциты (белые кровяные клетки), эритроциты (красные кровяные клетки) и тромбоциты, которые выполняют сложные функции в организме человека2. Прямой контакт инородных материалов с кровью может вызвать неблагоприятные последствия, такие как активация иммунной или свертывания системы, что может привести к воспалению или тромботические осложнения и серьезные проблемы после имплантации3,4,5. Такимобразом, in vitro гемосовместимость проверки предлагает возможность до имплантации, чтобы обнаружить и исключить любые гематологические осложнения, которые могут быть вызваны при контакте крови с инородной поверхности6.

Представленная модель цикла потока была создана для оценки гемосовместимости нервно-сосудистых стентов и аналогичных устройств путем применения скорости потока 150 мл/мин в трубах (диаметр 3,2 мм) для имитации условий мозгового потока и диаметров артерий2,7. Помимо необходимости оптимальной модели in vitro, источник крови является важным фактором при получении надежных и неизменных результатов при анализе гемосовместимости биоматериала8. Собранную кровь следует использовать сразу после взятия проб, чтобы предотвратить изменения, вызванные длительным хранением. В целом, нежный сбор крови без застоя с использованием 21 G иглы должны быть выполнены, чтобы свести к минимуму преактивации тромбоцитов и каскад коагуляции во время рисования крови. Кроме того, критерии исключения доноров включают тех, кто курит, беременна, находится в плохом состоянии здоровья или принимал оральные контрацептивы или обезболивающие в течение предыдущих 14 дней.

Это исследование описывает модель in vitro для обширного гемосовместимости тестирования стентных имплантатов в условиях потока. При сравнении с непокрытыми стентами с покрытием с фибрином-гепарином результаты комплексных тестов на гемосовместимость отражают улучшенную гемосовместимость стентов с покрытием фибрина-гепарина9. В отличие от этого, непокрытые стенты вызывают активацию каскада коагуляции, о чем свидетельствует увеличение концентраций томбин-антитромбина III (ТАТ) и потеря номеров тромбоцитов крови из-за привязки тромбоцитов к стентной поверхности. В целом, интеграция этой модели гемосовместимости в качестве доклинического теста рекомендуется для выявления любых побочных эффектов на гемостатической системе, которые вызваны устройством.

Protocol

Процедура отбора проб крови была одобрена Комитетом по этике медицинского факультета Университета Тюбингена (код идентификации проекта: 270/2010BO1). Все субъекты представили письменное, информированное согласие на включение до участия. 1. Подготовка гепаринов-загруженных мо…

Representative Results

Кратко обобщено, человеческая цельная кровь была собрана в гепарина загруженных моноветтах затем объединились и использовались для оценки базовых уровней клеточных отсчетов, а также плазматических маркеров гемосовместимости. Впоследствии труба, содержащая образцы не…

Discussion

Представленный протокол описывает всеобъемлющий и надежный метод для гемосовместимости тестирования кровоконтактных имплантатов в соответствии с ISO 10993-4 в модели потока сдвига, имитирующей поток крови человека. Это исследование основано на тестировании лазерной огранки нейрососуди…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

За выполнение сканирующей электронной микроскопии мы благодарим Эрнста Швайзера из секции медицинской материаловедения Университетской больницы Тубингена. Исследование было поддержано Министерством образования, молодежи и спорта ЧР в рамках Национальной программы устойчивого развития II (проект BIOCEV-FAR L-1604) и проектом Чешского научного фонда No 18-01163S.

Materials

aqua ad iniectabilia Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany 1088813
beta-TG ELISA Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany 00950
Centrifuge Rotana 460 R Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany
Citrat monovettes (1.4 mL) Sarstedt, Nümbrecht, Germany 6,16,68,001
CTAD monovettes (2.7 mL) BD Biosciences, Heidelberg, Germany 367562
EDTA monovettes (1.2 mL) Sarstedt, Nümbrecht, Germany 6,16,62,001
Ethanol p.A. (1000 mL) AppliChem, Darmstadt, Germany 1,31,08,61,611
Glutaraldehyde (25 % in water) SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany 23114.01
Heparin coating for tubes Ension, Pittsburgh, USA
Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL) LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany PZN 15261203
Multiplate Reader Mithras LB 940 Berthold, Bad Wildbad, Germany
NaCl 0,9% Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany 1312813
Neutral monovettes (9 mL) Sarstedt, Nümbrecht, Germany 2,10,63,001
PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 70011044
Peristaltic pump ISM444B Cole Parmer, Wertheim, Germany 3475
Pipette (100 µL) Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3124000075
Pipette (1000 µL) Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000063
Plastic container (100 mL) Sarstedt, Nümbrecht, Germany 7,55,62,300
PMN-Elastase ELISA Demeditec Diagnostics, Kiel Germany DEH3311
Polyvinyl chloride tube Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France
Reaction Tubes (1.5 mL) Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 30123328
neurovascular laser-cut implants Acandis GmbH, Pforzheim 01-0011x
SC5b-9 ELISA TECOmedical, Buende, Germany A029
Scanning electron microscope Cambridge Instruments, Cambridge, UK
Sealing tape (96 well plate) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 15036
Syringe 10/12 mL Norm-Ject Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany 10080010
TAT micro kit Siemens Healthcare, Marburg, Germany OWMG15
Waterbath Type 1083 Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel, Germany

Referências

  1. ISO. . Biological evaluation of medical devices. , (2002).
  2. Weber, M., et al. Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 99 (2018).
  3. Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine (Lond). 11 (3), 269-287 (2016).
  4. Cattaneo, G., et al. In vitro investigation of chemical properties and biocompatibility of neurovascular braided implants. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 30 (6), 67 (2019).
  5. Stang, K., et al. Hemocompatibility testing according to ISO 10993-4: discrimination between pyrogen- and device-induced hemostatic activation. Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 42, 422-428 (2014).
  6. van Oeveren, W. Obstacles in haemocompatibility testing. Scientifica (Cairo). , 392584 (2013).
  7. Engels, G. E., Blok, S. L., van Oeveren, W. In vitro blood flow model with physiological wall shear stress for hemocompatibility testing-An example of coronary stent testing. Biointerphases. 11 (3), 031004 (2016).
  8. Blok, S. L., Engels, G. E., van Oeveren, W. In vitro hemocompatibility testing: The importance of fresh blood. Biointerphases. 11 (2), 029802 (2016).
  9. Kaplan, O., et al. Low-thrombogenic fibrin-heparin coating promotes in vitro endothelialization. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2995-3005 (2017).
  10. . SEM Imaging of Biological Samples Available from: https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples (2019)
  11. Mohan, C. C., Chennazhi, K. P., Menon, D. In vitro hemocompatibility and vascular endothelial cell functionality on titania nanostructures under static and dynamic conditions for improved coronary stenting applications. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9568-9577 (2013).
  12. Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces. The Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 66 (1), 379-390 (2003).
  13. Sanak, M., Jakieła, B., Węgrzyn, W. Assessment of hemocompatibility of materials with arterial blood flow by platelet functional tests. Bulletin of the Polish Academy of Sciences: Technical Sciences. 58 (2), 317-322 (2010).
  14. Krajewski, S., et al. Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).
  15. Podias, A., Groth, T., Missirlis, Y. The effect of shear rate on the adhesion/activation of human platelets in flow through a closed-loop polymeric tubular system. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 6 (5), 399-410 (1994).
  16. Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers-a practical guide. Platelets. 23 (3), 229-242 (2012).
  17. Müller, M., Krolitzki, B., Glasmacher, B. Dynamic in vitro hemocompatibility testing-improving the signal to noise ratio. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 57, 549-552 (2012).
  18. Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around “air bubbles” in blood after venous air embolism. International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).
  19. Miller, R., et al. Characterisation of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 131 (1), 225-230 (1998).
  20. van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. International Journal of Biomaterials. , 673163 (2012).
  21. Krajewski, S., et al. Preclinical evaluation of the thrombogenicity and endothelialization of bare metal and surface-coated neurovascular stents. AJNR American Journal of Neuroradiology. 36 (1), 133-139 (2015).
  22. Monnink, S. H., et al. Silicon-carbide coated coronary stents have low platelet and leukocyte adhesion during platelet activation. Journal of Investigative Medicine. 47 (6), 304-310 (1999).
  23. Amoroso, G., van Boven, A. J., Volkers, C., Crijns, H. J., van Oeveren, W. Multilink stent promotes less platelet and leukocyte adhesion than a traditional stainless steel stent: an in vitro experimental study. Journal of Investigative Medicine. 49 (3), 265-272 (2001).
  24. Mulvihill, J., Crost, T., Renaux, J. L., Cazenave, J. P. Evaluation of haemodialysis membrane biocompatibility by parallel assessment in an ex vivo model in healthy volunteers. Nephrology Dialysis Transplantation. 12 (9), 1968-1973 (1997).
  25. Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium. Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).
check_url/pt/60610?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Link, A., Cattaneo, G., Brynda, E., Riedel, T., Kucerova, J., Schlensak, C., Wendel, H. P., Krajewski, S., Michel, T. Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow. J. Vis. Exp. (157), e60610, doi:10.3791/60610 (2020).

View Video