İnsan Kan Akışını Taklit Eden Akış Döngüsü Modelinde Kanla Temas Eden İmplantların Hemokomuuyum Testi
Summary
Bu protokol, lazer kesim nörovasküler implantlar kullanılarak kanla temas eden cihazların kapsamlı bir hemouyumluluk değerlendirmesini açıklamaktadır. Taze, heparinize insan kanı ile bir akış döngüsü modeli kan akışını taklit etmek için uygulanır. Perfüzyon sonrası çeşitli hematolojik belirteçler analiz edilir ve test edilen cihazların hemokompatibilite değerlendirmesi için kan alındıktan sonra doğrudan elde edilen değerlerle karşılaştırılır.
Abstract
Tıbbi cihazların (örneğin, vasküler greftler, stentler ve kardiyak kateterler) vücudun dolaşım sisteminde kalan geçici veya kalıcı amaçlarla giderek artan kullanımı, bu cihazların neden olduğu olası hematolojik komplikasyonları (örn. kan bileşenlerinin aktivasyonu ve imhası) değerlendiren güvenilir ve multiparametrik bir yaklaşım gerektirir. Kanla temas eden implantların kapsamlı in vitro hemouyumluluk testi, invivo uygulamada başarılı olması nın ilk adımıdır. Bu nedenle, Klinik uygulama öncesinde Uluslararası Standardizasyon Örgütü 10993-4 ‘e (ISO 10993-4) göre kapsamlı analiz zorunludur. Sunulan akış döngüsü stentlerin hemostatik performansını analiz etmek için hassas bir modeli açıklar (bu durumda, nörovasküler) ve yan etkileri ortaya. Taze insan tam kan ve nazik kan örnekleme kullanımı kan preaktivasyonu önlemek için gereklidir. Kan, test numunesini içeren heparinize bir tüp ile 37 °C’de 150 mL/dk hızda 60 dakika peristaltik pompa kullanılarak geçirilir. Perfüzyon öncesi ve sonrası hematolojik belirteçler (örn. lökositlerin aktivasyonunu gösteren kan hücre sayısı, hemoglobin, hematokrit ve plazmatik belirteçler (polimorfonükleer [PMN]-elastaz), trombositler (β-tromboglobulin [β-TG]), koagülasyon sistemi (thombin-antitrombin III [TAT]) ve ardan ardeksi (SC5b-9) olarak analiz edilir. Sonuç olarak, klinik uygulama öncesinde stentlerin ve diğer kanla temas eden cihazların kapsamlı hemouyumluluk testi için gerekli ve güvenilir bir model salıyoruz.
Introduction
İmplantların ve biyomalzemelerin insan kanıyla etkileşime giren in vivo uygulaması, hemostatik sistemin çeşitli belirteçlerinin araştırılmasına odaklanan yoğun klinik öncesi testler gerektirir. Uluslararası Standardizasyon Örgütü 10993-4 (ISO 10993-4) kanla temas eden cihazların (yani stent ve vasküler greftlerin) değerlendirilmesi için temel ilkeleri belirtir ve cihaz tasarımını, klinik yararını ve gerekli malzemeleri1olarak değerlendirir.
İnsan kanı, lökositler (beyaz kan hücreleri [WBCs]), eritrositler (kırmızı kan hücreleri [RBCs]) ve trombositler gibi çeşitli plazma proteinlerive hücreleri içeren bir sıvıdır. Kan ile yabancı maddelerin doğrudan temas yan etkilere neden olabilir, bağışıklık veya koagülasyon sisteminin aktivasyonu gibi, hangi inflamasyon veya trombotik komplikasyonlara yol açabilir ve implantasyon sonrası ciddi sorunlara yol açabilir3,4,5. Bunedenle, in vitro hemouyumluluk doğrulama yabancı bir yüzey ile kan teması üzerine indüklenen olabilir herhangi bir hematolojik komplikasyonları tespit etmek ve dışlamak için implantasyon öncesinde bir fırsat sunuyor6.
Sunulan akış döngüsü modeli beyin akış koşulları ve arter çapları taklit etmek için tüp (3.2 mm çapı) 150 mL /dk akış hızı uygulanarak nörovasküler stent ve benzeri cihazların hemouyumluluğunu değerlendirmek için kurulmuştur2,7. Optimal in vitro modeli için ihtiyaç yanı sıra, kan kaynağı güvenilir ve değişmemiş sonuçlar elde önemli bir faktördürbiyomalzemehemouyumluluğu analiz 8 . Toplanan kan, uzun süreli depolamanın neden olduğu değişiklikleri önlemek için örneklemeden hemen sonra kullanılmalıdır. Genel olarak, trombositlerin ön aktivasyonunu ve kan çekimi sırasında pıhtılaşmayı en aza indirmek için 21 G iğne kullanarak durağan olmadan hafif bir kan toplanması yapılmalıdır. Ayrıca, donör dışlama kriterleri sigara içenler, hamile olanlar, sağlık kötü durumda, ya da önceki 14 gün boyunca oral kontraseptif veya ağrı kesici almış olanlar içerir.
Bu çalışmada, akış koşullarında stent implantlarının kapsamlı hemokompatibilite testi için in vitro bir model açıklanmaktadır. Fibrin-heparin kaplı stentler ile kaplamasız karşılaştırırken, kapsamlı hemouyumluluk testlerinin sonuçları fibrin-heparin kaplı stentlerin geliştirilmiş hemouyumluluğunu yansıtır9. Buna karşılık, kaplamasız stentler koagülasyon kaskad aktivasyonu neden, thombin-antitrombin III bir artış ve stent yüzeyine trombosit yapışması nedeniyle kan trombosit numaraları kaybı gösterildiği gibi. Genel olarak, bu hemouyumluluk modelinin klinik öncesi bir test olarak entegre edilmesi, cihazın neden olduğu hemostatik sistem üzerindeki herhangi bir yan etkiyi saptamak için önerilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sunulan protokol, insan kan akışını taklit eden bir kesme akışı modelinde ISO 10993-4 uyarınca kanla temas eden implantların hemouyumluluk testi için kapsamlı ve güvenilir bir yöntemi tanımlar. Bu çalışma lazer kesim nörovasküler implantların test dayanmaktadır ama çeşitli örnekler ile yapılabilir. Sonuçlar, bu yöntemin kan hücresi sayısı, çeşitli hemokompatibilite belirteçlerinin yaygınlığı ve kan teması sonrası cihaz yüzeyinin mikroskobik görselleştirmesi gibi çeşitli paramet…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Taramalı elektron mikroskobu performansı için, Üniversite Hastanesi Tuebingen Tıbbi Malzeme Bilimi ve Teknolojisi bölümünden Ernst Schweizer’a teşekkür ederiz. Araştırma, Ulusal Sürdürülebilirlik Programı II (Project BIOCEV-FAR LQ1604) kapsamında Cr’nin Eğitim, Gençlik ve Spor Bakanlığı ve Çek Bilim Vakfı’nın 18-01163S projesi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| aqua ad iniectabilia | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1088813 | |
| beta-TG ELISA | Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany | 00950 | |
| Centrifuge Rotana 460 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | – | |
| Citrat monovettes (1.4 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,68,001 | |
| CTAD monovettes (2.7 mL) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 367562 | |
| EDTA monovettes (1.2 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,62,001 | |
| Ethanol p.A. (1000 mL) | AppliChem, Darmstadt, Germany | 1,31,08,61,611 | |
| Glutaraldehyde (25 % in water) | SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany | 23114.01 | |
| Heparin coating for tubes | Ension, Pittsburgh, USA | – | |
| Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL) | LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany | PZN 15261203 | |
| Multiplate Reader Mithras LB 940 | Berthold, Bad Wildbad, Germany | – | |
| NaCl 0,9% | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1312813 | |
| Neutral monovettes (9 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 2,10,63,001 | |
| PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| Peristaltic pump ISM444B | Cole Parmer, Wertheim, Germany | 3475 | |
| Pipette (100 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3124000075 | |
| Pipette (1000 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3123000063 | |
| Plastic container (100 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 7,55,62,300 | |
| PMN-Elastase ELISA | Demeditec Diagnostics, Kiel Germany | DEH3311 | |
| Polyvinyl chloride tube | Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France | – | |
| Reaction Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 30123328 | |
| neurovascular laser-cut implants | Acandis GmbH, Pforzheim | 01-0011x | |
| SC5b-9 ELISA | TECOmedical, Buende, Germany | A029 | |
| Scanning electron microscope | Cambridge Instruments, Cambridge, UK | – | |
| Sealing tape (96 well plate) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15036 | |
| Syringe 10/12 mL Norm-Ject | Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany | 10080010 | |
| TAT micro kit | Siemens Healthcare, Marburg, Germany | OWMG15 | |
| Waterbath Type 1083 | Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel, Germany | – |
Referências
- ISO. . Biological evaluation of medical devices. , (2002).
- Weber, M., et al. Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 99 (2018).
- Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine (Lond). 11 (3), 269-287 (2016).
- Cattaneo, G., et al. In vitro investigation of chemical properties and biocompatibility of neurovascular braided implants. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 30 (6), 67 (2019).
- Stang, K., et al. Hemocompatibility testing according to ISO 10993-4: discrimination between pyrogen- and device-induced hemostatic activation. Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 42, 422-428 (2014).
- van Oeveren, W. Obstacles in haemocompatibility testing. Scientifica (Cairo). , 392584 (2013).
- Engels, G. E., Blok, S. L., van Oeveren, W. In vitro blood flow model with physiological wall shear stress for hemocompatibility testing-An example of coronary stent testing. Biointerphases. 11 (3), 031004 (2016).
- Blok, S. L., Engels, G. E., van Oeveren, W. In vitro hemocompatibility testing: The importance of fresh blood. Biointerphases. 11 (2), 029802 (2016).
- Kaplan, O., et al. Low-thrombogenic fibrin-heparin coating promotes in vitro endothelialization. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2995-3005 (2017).
- . SEM Imaging of Biological Samples Available from: https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples (2019)
- Mohan, C. C., Chennazhi, K. P., Menon, D. In vitro hemocompatibility and vascular endothelial cell functionality on titania nanostructures under static and dynamic conditions for improved coronary stenting applications. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9568-9577 (2013).
- Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces. The Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 66 (1), 379-390 (2003).
- Sanak, M., Jakieła, B., Węgrzyn, W. Assessment of hemocompatibility of materials with arterial blood flow by platelet functional tests. Bulletin of the Polish Academy of Sciences: Technical Sciences. 58 (2), 317-322 (2010).
- Krajewski, S., et al. Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).
- Podias, A., Groth, T., Missirlis, Y. The effect of shear rate on the adhesion/activation of human platelets in flow through a closed-loop polymeric tubular system. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 6 (5), 399-410 (1994).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers-a practical guide. Platelets. 23 (3), 229-242 (2012).
- Müller, M., Krolitzki, B., Glasmacher, B. Dynamic in vitro hemocompatibility testing-improving the signal to noise ratio. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 57, 549-552 (2012).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around “air bubbles” in blood after venous air embolism. International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).
- Miller, R., et al. Characterisation of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 131 (1), 225-230 (1998).
- van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. International Journal of Biomaterials. , 673163 (2012).
- Krajewski, S., et al. Preclinical evaluation of the thrombogenicity and endothelialization of bare metal and surface-coated neurovascular stents. AJNR American Journal of Neuroradiology. 36 (1), 133-139 (2015).
- Monnink, S. H., et al. Silicon-carbide coated coronary stents have low platelet and leukocyte adhesion during platelet activation. Journal of Investigative Medicine. 47 (6), 304-310 (1999).
- Amoroso, G., van Boven, A. J., Volkers, C., Crijns, H. J., van Oeveren, W. Multilink stent promotes less platelet and leukocyte adhesion than a traditional stainless steel stent: an in vitro experimental study. Journal of Investigative Medicine. 49 (3), 265-272 (2001).
- Mulvihill, J., Crost, T., Renaux, J. L., Cazenave, J. P. Evaluation of haemodialysis membrane biocompatibility by parallel assessment in an ex vivo model in healthy volunteers. Nephrology Dialysis Transplantation. 12 (9), 1968-1973 (1997).
- Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium. Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).
