الجمع بين الليزر التقاط Microdissection وMicrofluidic qPCR لتحليل الملامح النسخية للخلايا المفردة: نهج بيولوجيا النظم للاعتماد على المواد الأفيونية
Summary
يشرح هذا البروتوكول كيفية جمع الخلايا العصبية المفردة وmicroglia والخلايا الفلكية من النواة المركزية للأميغدالا بدقة عالية وخصوصية تشريحية باستخدام المجهر الالتقاط بالليزر. بالإضافة إلى ذلك، نشرح استخدامنا لـ RT-qPCR الميكروسيولية لقياس مجموعة فرعية من النسخ من هذه الخلايا.
Abstract
تشير التغايرية النسخة العميقة في الخلايا المفردة المجاورة تشريحياً إلى أنه يمكن تحقيق وظائف الأنسجة القوية من خلال تنوع النمط الظاهري الخلوي. وتبين التجارب أحادية الخلية التي تحقق ديناميات الشبكة للنظم البيولوجية استجابات خلوية وأنسجة لمختلف الظروف بدقة بيولوجية. هنا، نشرح أساليبنا لجمع خلايا مفردة من مواقع محددة تشريحياً وقياس مجموعة فرعية بدقة من ملامح التعبير الجيني الخاصة بهم. نحن نجمع بين microdissection التقاط الليزر (LCM) مع النسخ العكسية microfluidic التفاعلات المتسلسلة البوليميراز الكمية (RT-qPCR). كما نستخدم هذه المنصة MICROfluidic RT-qPCR لقياس الوفرة الميكروبية لمحتويات الأمعاء.
Introduction
وقد أظهرت قياس ملامح التعبير الجيني للخلايا واحدة التغايرية واسعة فينوتيبيك داخل الأنسجة. وقد أدى هذا التعقيد إلى تعقيد فهمنا للشبكات البيولوجية التي تحكم وظيفة الأنسجة. وقد استكشفت مجموعتنا وغيرها هذه الظاهرة في العديد من الأنسجة والظروف1،2،3،4،5،6. هذه التجارب لا تشير فقط إلى أن تنظيم شبكات التعبير الجيني تكمن وراء هذا التغاير ، ولكن أيضا أن دقة الخلية الواحدة يكشف عن تعقيد في وظيفة الأنسجة أن القرار على مستوى الأنسجة لا نقدر. في الواقع، مجرد أقلية صغيرة من الخلايا قد تستجيب لحالة محددة أو التحدي، ولكن تأثير تلك الخلايا على علم وظائف الأعضاء عموما قد يكون كبيرا. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لنهج بيولوجيا النظام الذي يطبق أساليب متعددة المتغيرات على مجموعات البيانات عالية الأبعاد من أنواع الخلايا والأنسجة المتعددة توضيح آثار العلاج على مستوى النظام.
نحن نجمع LCM وMICROfluidic RT-qPCR للحصول على مجموعات البيانات هذه. نحن نتخذ هذا النهج هنا على النقيض من جمع الخلايا المفردة عبر فرز الخلايا المنشط ة بالفلور (FACS) واستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq) لقياس النسخ الخاصة بهم. ميزة LCM على FACS هي أنه يمكن توثيق التحديد التشريحي الدقيق للخلايا المفردة باستخدام LCM ، نسبيًا ومطلقًا. وعلاوة على ذلك، في حين أن الجيش الملكي النيبالي-seq يمكن قياس المزيد من الميزات التي RT-qPCR، microfluidic RT-qPCR هو أقل تكلفة ولديه حساسية أعلى وخصوصية7.
في هذه التجربة التمثيلية ، قمنا بالتحقيق في آثار الاعتماد على المواد الأفيونية وانسحاب المواد الأفيونية النالتريكسون المعجل على الخلايا العصبية الجرذانية ، microglia ، والتعبير الجيني الفلكي في النواة المركزية للأميغدالا (CeA) ووفرة البكتيريا الأمعاء4. تم تحليل أربع مجموعات العلاج: 1) وهمي، 2) المورفين، 3) نالتريكسون، و 4) الانسحاب(الشكل 1). وجدنا أن الاعتماد على المواد الأفيونية لم يغير بشكل كبير التعبير الجيني ، ولكن انسحاب المواد الأفيونية أدى إلى التعبير عن الجينات الالتهابية ، Tnf على وجه الخصوص. الخلايا الفلكية كانت أكثر أنواع الخلايا تضرراً. تأثر ميكروبيوم الأمعاء بشدة بانسحاب المواد الأفيونية كما هو مبين في انخفاض نسبة Firmicutes إلى البكتيريا ، وهي علامة ثابتة على خلل التنسج الأمعاء8،9.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أظهرت البيولوجيا وحيدة الخلية عدم تجانس الأنماط الظاهرية الخلوية ومتانة وظيفة الأنسجة. وقد وفرت هذه النتائج نظرة ثاقبة على تنظيم النظم البيولوجية على المستويين الكلي والجزئي. هنا ، نصف الجمع بين طريقتين ، LCM وqPCR microfluidic ، للحصول على مقاييس النسخ أحاديالخلية التي توفر خصوصية تشريحية ود…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل العمل المقدم هنا من خلال المعاهد القومية للصحة HLB U01 HL133360 الممنوحة لJS و RV، NIDA R21 DA036372 منحت لJS و EVB، وT32 AA-007463 منحت ليان هوك دعما لSJO’s.
Materials
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-48.48 | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | A-21294 | Astrocyte Stain |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal™ Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A28175 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | Rox master mix |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
Referências
- Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24, 930-941 (2014).
- Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 87-98 (2015).
- Park, J., et al. Single-Cell Transcriptional Analysis Reveals Novel Neuronal Phenotypes and Interaction Networks Involved in the Central Circadian Clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481 (2016).
- O’Sullivan, S. J., et al. Single-Cell Glia and Neuron Gene Expression in the Central Amygdala in Opioid Withdrawal Suggests Inflammation With Correlated Gut Dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665 (2019).
- Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nature Biotechnology. 33, 155-160 (2015).
- Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Reviews Immunolology. 18, 35-45 (2018).
- SEQC/MAQC-III Consortium. A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium. Nature Biotechnology. 32, 903-914 (2014).
- Rowin, J., Xia, Y., Jung, B., Sun, J. Gut inflammation and dysbiosis in human motor neuron disease. Physiological Reports. 5, (2017).
- Tamboli, C. P., Neut, C., Desreumaux, P., Colombel, J. F. Dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut. 53, 1-4 (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , (2006).
