Combinación de microdisección de captura láser y qPCR microfluídico para analizar perfiles transcripcionales de células únicas: un enfoque de biología de sistemas para la dependencia de opioides
Summary
Este protocolo explica cómo recoger neuronas individuales, microglia y astrocitos del núcleo central de la amígdala con alta precisión y especificidad anatómica utilizando microdisección de captura láser. Además, explicamos nuestro uso de RT-qPCR microfluídico para medir un subconjunto del transcriptoma de estas células.
Abstract
La heterogeneidad transcripcional profunda en células individuales anatómicamente adyacentes sugiere que la funcionalidad sólida del tejido puede lograrse mediante la diversidad de fenotipos celulares. Experimentos de una sola célula que investigan la dinámica de la red de los sistemas biológicos demuestran respuestas celulares y tisulares a diversas condiciones a una resolución biológicamente significativa. En este documento, explicamos nuestros métodos para recopilar células individuales de ubicaciones anatómicamente específicas y medir con precisión un subconjunto de sus perfiles de expresión génica. Combinamos la microdisección de captura láser (LCM) con reacciones en cadena cuantitativas de la polimerasa de transcripción inversa microfluídica (RT-qPCR). También utilizamos esta plataforma microfluídica RT-qPCR para medir la abundancia microbiana de contenido intestinal.
Introduction
La medición de los perfiles de expresión génica de células individuales ha demostrado una extensa heterogeneidad fenotípica dentro de un tejido. Esta complejidad ha complicado nuestra comprensión de las redes biológicas que gobiernan la función del tejido. Nuestro grupo y otros han explorado este fenómeno en muchos tejidos y condiciones1,2,3,4,5,6. Estos experimentos no sólo sugieren que la regulación de las redes de expresión génica subyace a tal heterogeneidad, sino también que la resolución de una sola célula revela una complejidad en la función del tejido que la resolución a nivel de tejido no aprecia. De hecho, sólo una pequeña minoría de células puede responder a una condición o desafío específico, pero el impacto de esas células en la fisiología general puede ser sustancial. Además, un enfoque de biología del sistema que aplica métodos multivariantes a conjuntos de datos de alta dimensión de múltiples tipos de células y tejidos puede dilucidar los efectos del tratamiento en todo el sistema.
Combinamos LCM y RT-qPCR microfluídico para obtener dichos conjuntos de datos. Tomamos este enfoque aquí en contraste con la recolección de células individuales a través de la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y el uso de secuenciación de ARN (RNA-seq) para medir su transcriptoma. La ventaja de LCM sobre FACS es que la especificidad anatómica exacta de las células individuales se puede documentar con LCM, relativamente y absolutamente. Además, mientras que el ARN-seq puede medir más características que RT-qPCR, RT-qPCR microfluídico es menos costoso y tiene una mayor sensibilidad y especificidad7.
En este experimento representativo, investigamos los efectos de la dependencia de opioides y la abstinencia de opioides con precipitación de naltrexona en la expresión génica neuronal, microglia y astrocito en el núcleo central de la amígdala (CeA) y la abundancia de microflora intestinal4. Se analizaron cuatro grupos de tratamiento: 1) Placebo, 2) Morfina, 3) Naltrexona y 4) Retiro (Figura 1). Encontramos que la dependencia de opioides no alteraba sustancialmente la expresión génica, pero que la abstinencia de opioides indució la expresión de genes inflamatorios, Tnf en particular. Los astrocitos eran el tipo de célula más afectado. El microbioma intestinal se vio profundamente afectado por la abstinencia de opioides como lo indica una disminución en la relación Firmicutes a Bacteroides, que es un marcador establecido de disbiosis intestinal8,9.
Protocol
Representative Results
Discussion
La biología de una sola célula ha demostrado la heterogeneidad de los fenotipos celulares y la robustez de la función tisular. Estos hallazgos han proporcionado información sobre la organización de sistemas biológicos tanto a escala macro como a microescala. Aquí, describimos la combinación de dos métodos, LCM y qPCR microfluídico, para obtener medidas de transcriptoma de una sola célula que proporcionen especificidad anatómica y precisión transcripcional a un costo relativamente bajo(Fi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo presentado aquí fue financiado a través de NIH HLB U01 HL133360 otorgado a JS y RV, NIDA R21 DA036372 otorgado a JS y EVB, y T32 AA-007463 otorgado a Jan Hoek en apoyo de SJO’S.
Materials
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-48.48 | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | A-21294 | Astrocyte Stain |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal™ Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A28175 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | Rox master mix |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
Referências
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- Park, J., et al. Single-Cell Transcriptional Analysis Reveals Novel Neuronal Phenotypes and Interaction Networks Involved in the Central Circadian Clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481 (2016).
- O’Sullivan, S. J., et al. Single-Cell Glia and Neuron Gene Expression in the Central Amygdala in Opioid Withdrawal Suggests Inflammation With Correlated Gut Dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665 (2019).
- Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nature Biotechnology. 33, 155-160 (2015).
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