שילוב לכידת לייזר ובדיקות מיקרופלוטואידים לניתוח פרופילים של תאים בודדים: גישת ביולוגיה של מערכות לתלותיות באופטואיד
Summary
פרוטוקול זה מסביר כיצד לאסוף נוירונים בודדים, microglia, ו אסטרוציטים מן הגרעין המרכזי של האמיגדלה עם דיוק גבוהה וספציפיות אנטומיים באמצעות לכידת לייזר מיקרוניתוח לכידה. בנוסף, אנו מסבירים את השימוש שלנו במיקרופלואידיג RT-qPCR כדי למדוד תת-קבוצה של התאים הללו.
Abstract
מעמיק טרוגניות tional בתאים בודדים מבחינה אנטומית מרמז כי הפונקציונליות רקמה חזקה ניתן להשיג על ידי הגיוון פנוטיפ הסלולר. ניסויים בתאים בודדים החוקרים את דינמיקת הרשת של מערכות ביולוגיות מדגימים תגובות תאית ורקמה לתנאים שונים ברזולוציה משמעותית ביולוגית. בזאת, נסביר את השיטות שלנו לאיסוף תאים בודדים ממיקומים ספציפיים מבחינה אנטומית ולמדידת מדויק של תת-ערכה של פרופילי הביטוי הגנטי שלהם. אנו משלבים לכידת לייזר מיקרודיסקציה (LCM) עם שעתוק מיקרופלואידיג הפוך תגובות פולימראז כמותיים (RT-qPCR). אנו משתמשים גם זה מיקרופלואידיק RT-qPCR פלטפורמה כדי למדוד את השפע של מיקרוביאלית של תכולת המעיים.
Introduction
מדידת פרופילי ביטוי גנים של תאים בודדים הפגינו טרוגניות פנוטימית נרחבת בתוך רקמה. מורכבות זו מסובכת את הבנתנו את הרשתות הביולוגי המפקחות על תפקוד הרקמה. הקבוצה שלנו ואחרים חקרו את התופעה הזאת ברקמות ובתנאים רבים1,2,3,4,5,6. ניסויים אלה לא רק להציע כי התקנה של רשתות ביטוי גנים ושתתות כזה, אלא גם כי ברזולוציה תא יחיד מגלה מורכבות בתפקוד רקמות כי ברמת רקמת הרזולוציה לא מעריכים. אכן, רק מיעוט קטן של תאים יכול להגיב למצב מסוים או אתגר, אבל ההשפעה של תאים אלה על הפיזיולוגיה הכללית עשוי להיות משמעותי. בנוסף, גישת ביולוגיה של המערכת החלה על שיטות מרובות לערכות נתונים ממדיות גבוהות מסוגי תאים מרובים ומרקמות שיכולות להבהיר אפקטי טיפול כלל-מערכתיים.
אנו משלבים LCM ו-microfluidic RT-qPCR כדי להשיג מערכות נתונים כאלה. אנו לוקחים את הגישה הזאת כאן בניגוד לאיסוף תאים בודדים באמצעות מיון תא המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית (FACS) ובאמצעות רצפי RNA (RNA-seq) כדי למדוד את ההמרה שלהם. היתרון של LCM על FACS הוא כי הספציפיות האטומי של תאים בודדים יכול להיות מתועד עם LCM, יחסית ובהחלט. עוד, בעוד RNA-seq יכול למדוד יותר תכונות כי RT-qPCR, microfluidic RT-qPCR הוא פחות יקר ויש לו רגישות גבוהה יותר וספציפיות7.
בניסוי מייצג זה, חקרנו את ההשפעות של התלות באופטואיד והנסיגה נלוקסן-משיכה מגנטית על עצבי חולדה, microglia, וביטוי גנים אסטרוציט בגרעין המרכזי של האמיגדלה (מיקרומית) ושפע של הבטן המיקרופלורה4. ארבע קבוצות טיפול נותחו: 1) פלצבו, 2) מורפיום, 3) נלוקסן, ו-4) משיכה (איור 1). מצאנו כי התלות באופנואיד לא שינו באופן משמעותי את הביטוי הגנטי, אבל הנסיגה האופאידית הנגרמת ביטוי של גנים דלקתיים, Tnf בפרט. האסטרוציטים היו סוג התא המושפע ביותר. מיקרובידום הבטן היה מושפע עמוקות על ידי נסיגה מאופנואיד כפי שמצוין על ידי ירידה בתוך היחס בקטטואידים, שהוא מסמן מבוסס על הבטן בתפקוד8,9.
Protocol
Representative Results
Discussion
ביולוגיה של תא בודד הוכיחה את טרוגניות של פנוטיפים סלולריים והחוסן של תפקוד רקמות. ממצאים אלה סיפקו תובנה לארגון של מערכות ביולוגיות בשני מאקרו ומיקרו קשקשים. כאן, אנו מתארים את השילוב של שתי שיטות, LCM ו-microfluidic qPCR, כדי להשיג תא בודד מדדים הטרנססקריפט המספקים הספציפיות האטומית ודיוק הטרנססק…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה המוצגת כאן ממומנת באמצעות NIH HLB U01 HL133360 הוענק JS ו-RV, NIDA R21 DA036372 הוענק JS ו EVB, T32 AA-007463 הוענק יאן הוק תמיכה של SJO של.
Materials
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-48.48 | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | A-21294 | Astrocyte Stain |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal™ Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A28175 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | Rox master mix |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
Referências
- Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24, 930-941 (2014).
- Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 87-98 (2015).
- Park, J., et al. Single-Cell Transcriptional Analysis Reveals Novel Neuronal Phenotypes and Interaction Networks Involved in the Central Circadian Clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481 (2016).
- O’Sullivan, S. J., et al. Single-Cell Glia and Neuron Gene Expression in the Central Amygdala in Opioid Withdrawal Suggests Inflammation With Correlated Gut Dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665 (2019).
- Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nature Biotechnology. 33, 155-160 (2015).
- Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Reviews Immunolology. 18, 35-45 (2018).
- SEQC/MAQC-III Consortium. A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium. Nature Biotechnology. 32, 903-914 (2014).
- Rowin, J., Xia, Y., Jung, B., Sun, J. Gut inflammation and dysbiosis in human motor neuron disease. Physiological Reports. 5, (2017).
- Tamboli, C. P., Neut, C., Desreumaux, P., Colombel, J. F. Dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut. 53, 1-4 (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , (2006).
