Este protocolo explica como coletar neurônios únicos, microglia e astrócitos do núcleo central da amígdala com alta precisão e especificidade anatômica usando microdissecção de captura a laser. Além disso, explicamos nosso uso de RT-qPCR microfluido para medir um subconjunto do transcriptome dessas células.
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Artigo de método
Combinando microdissecção de captura a laser e qPCR microfluido para analisar perfis transcricional de células únicas: uma abordagem de biologia de sistemas para dependência de opióides
Neste artigo
Resumo
Resumo
A heterogeneidade transcricional profunda em células únicas anatomicamente adjacentes sugere que a funcionalidade robusta do tecido pode ser alcançada pela diversidade de fenótipo celular. Experimentos de células únicas que investigam a dinâmica da rede de sistemas biológicos demonstram respostas celulares e teciduais a várias condições em resolução biologicamente significativa. Aqui, explicamos nossos métodos para coletar células únicas de locais anatomicamente específicos e medir com precisão um subconjunto de seus perfis de expressão genética. Combinamos a microdissecção de captura a laser (LCM) com a transcrição reversa microfluida quantitativa de reações em cadeia de polimerase (RT-qPCR). Também usamos esta plataforma microfluida RT-qPCR para medir a abundância microbiana de conteúdo intestinal.
Introdução
Medir os perfis de expressão genética de células únicas demonstrou extensa heterogeneidade ferotípica dentro de um tecido. Essa complexidade complicou nossa compreensão das redes biológicas que regem a função tecidual. Nosso grupo e outros têm explorado esse fenômeno em muitos tecidos e condições1,2,3,4,5,6. Esses experimentos não apenas sugerem que a regulação das redes de expressão genética sustenta tal heterogeneidade, mas também que a resolução de células únicas revela....
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Protocolo
Este estudo foi realizado de acordo com as recomendações do Comitê de Cuidados e Uso animal (IACUC) da Universidade Thomas Jefferson e da Faculdade de Medicina da Universidade Drexel. O protocolo foi aprovado pela Universidade Thomas Jefferson e pela Drexel University College of Medicine IACUC.
1. Modelo animal
- Insira duas pelotas de sulfato de morfina de liberação lenta de 75 mg ou duas pelotas de placebo subcutâneas em ratos machos adultos sprague-Dawley.
- Use um vestido e luvas apropriadamente para uma pequena cirurgia estéril. Raspe o dorsum de rato com cortadores, se necessário.
- Aplique pomada veterinária no....
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Resultados
A seleção das células únicas foi validada visual mente e molecularmente. Visualmente, a morfologia celular foi vista antes da coleta celular. As células coletadas foram então visualizadas na estação QC e a mancha de núcleos celulares (DAPI) se sobrepôs à fluorescência do marcador de seleção de células únicas. A Figura 2A mostra imagens representativas de um slide com o antecérebro de rato hemissilado contendo o CeA. Imagens subseqüentes (
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Discussão
A biologia unicelular demonstrou a heterogeneidade dos fenótipos celulares e a robustez da função tecidual. Esses achados forneceram insights sobre a organização de sistemas biológicos em escalas macro e micro. Aqui, descrevemos a combinação de dois métodos, LCM e qPCR microfluido, para obter medidas de transcriptome unicelular que fornecem especificidade anatômica e precisão transcricional a um custo relativamente baixo (Figura 1). Nosso grupo adota uma abordagem de biologia de sistemas e m.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
O trabalho aqui apresentado foi financiado através do NIH HLB U01 HL133360 concedido à JS e RV, NIDA R21 DA036372 concedido à JS e EVB, e T32 AA-007463 concedido a Jan Hoek em apoio à SJO's.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Ensaio Carregamento Reagente | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 48.48 Dynamic Array IFC para | Fluidigm | BMK-M-48.48 | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC para | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-CD11β Anticorpo | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Anticorpo, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Coloração Neuronal |
| ArcturusXT Sistema de Microdissecção de Captura a Laser | Arcturus | NA | |
| NA Biomark HD | Fluidigm | NA | Plataforma RT-qPCR |
| Antígeno de Soro Bovino | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Componentes da solução tampão de lise |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| Dispositivo de extração de amostras ExtracSure | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| Fisherbrand Superfrost Plus Lâminas de microscópio | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Lâminas de vidro liso |
| Tubo de reação de paredes finas | GeneAmp Scientific | N8010611 | |
| GFAP Anticorpo monoclonal | ThermoFisher Scientific ThermoFisher Scientific | A-21294 | Coloração de Astrócito |
| Cabra anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal™ Anticorpo secundário recombinante, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A28175 | Seconadry Anticorpo |
| IFC Controlador | Fluidigm | NA | |
| NA RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix com baixo Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | Rox master mix |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher A Scientific | 11754250 | contém a proteína VILO e SuperScript |
| T4 Gene 32 New | Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
Referências
- Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24, 930-941 (2014).
- Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single ....
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Reimpressões e permissões
