Análise Quantitativa do Lipidome Celular de Saccharomyces Cerevisiae Usando Cromatografia Líquida Juntamente com Espectrometria de Massa de Tandem

Summary

Apresentamos um protocolo utilizando cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem para identificar e quantificar os principais lipídios celulares em Saccharomyces cerevisiae. O método descrito para uma avaliação quantitativa das principais classes lipídicas dentro de uma célula de levedura é versátil, robusto e sensível.

Abstract

Lipídios são moléculas anfípticas estruturalmente diversas que são insolúveis em água. Os lipídios são contribuintes essenciais para a organização e função das membranas biológicas, armazenamento e produção de energia, sinalização celular, transporte vesicular de proteínas, biogênese organela e morte celular regulada. Como a levedura brotante Saccharomyces cerevisiae é um eucariote unicelular passível de análises moleculares completas, seu uso como organismo modelo ajudou a descobrir mecanismos que ligam o metabolismo lipídico e o transporte intracelular a processos biológicos complexos dentro de células eucarióticas. A disponibilidade de um método analítico versátil para a avaliação quantitativa robusta, sensível e precisa das principais classes de lipídios dentro de uma célula de levedura é crucial para obter insights profundos sobre esses mecanismos. Aqui apresentamos um protocolo de utilização de cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem (LC-MS/MS) para a análise quantitativa dos principais lipídios celulares de S. cerevisiae. O método LC-MS/MS descrito é versátil e robusto. Permite a identificação e quantificação de inúmeras espécies (incluindo diferentes formas isóbaras ou isóricas) dentro de cada uma das 10 classes lipídicas. Este método é sensível e permite a identificação e quantitação de algumas espécies lipídicas em concentrações tão baixas quanto 0,2 pmol/μL. O método tem sido aplicado com sucesso na avaliação de lipidomas de células inteiras de levedura e suas organelas purificadas. O uso de aditivos de fase móvel alternativos para espectrometria de massa de ionização eletrospray neste método pode aumentar a eficiência da ionização para algumas espécies lipídicas e, portanto, pode ser usado para melhorar sua identificação e quantitação.

Introduction

Um conjunto de evidências indica que os lipídios, uma das principais classes de biomoléculas, desempenham papéis essenciais em muitos processos vitais dentro de uma célula eucariótica. Esses processos incluem a montagem de bicamadas lipídicas que constituem a membrana plasmática e as membranas ao redor de organelas celulares, o transporte de pequenas moléculas através das membranas celulares, a resposta a alterações no ambiente extracelular e transdução de sinal intracelular, geração e armazenamento de energia, importação e exportação de proteínas confinadas a diferentes organelas, tráfico vesicular de proteínas dentro do sistema de endomembrana e secreção de proteína....

Protocol

1. Preparação de mídia estéril para cultivar levedura

1. Prepare 90 mL de um meio YP completo que contenha 1% (c/v) de extrato de levedura e 2% (c/v) bactopepnona.
2. Preparar 90 mL de um meio ynb mínimo sintético contendo 0,67% (c/v) base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos, 20 mg/L -histidina, 30 mg/L -leucina, 30 mg/L -lysina e 20 mg/L uracil.
3. Divida 90 mL do meio YP completo igualmente em dois frascos erlenmeyer de 250 mL (ou seja, 45 mL cada).
4. Divida 90 mL do meio sintético mínimo YNB em dois frascos Erlenmeyer de 250 mL (ou seja, 45 mL cada).
5. Autoclave os frascos com mídia YP e YNB a 15....

Results

Nosso método para uma avaliação quantitativa dos principais lipídios celulares dentro de uma célula de levedura com a ajuda de LC-MS/MS foi versátil e robusto. Permitiu identificar e quantificar 10 classes lipídicas diferentes em células s. cerevisiae cultivadas no meio nINS mínimo sintético contendo inicialmente 2% de glicose. Estas classes lipídicas incluem ácidos graxos gratuitos (não esestrdiados) (AFa), CL, fitoceramide (APS), fitosofingosina (PHS), PC, PE, PG, PI, PS e TAG<.......

Discussion

As seguintes precauções são importantes para a implementação bem sucedida do protocolo descrito aqui:

1. Clorofórmio e metanol são tóxicos. Eles extraem eficientemente várias substâncias de superfícies, incluindo plástico de laboratório e sua pele. Portanto, manuseie esses solventes orgânicos com cautela, evitando o uso de plásticos em etapas que envolvam contato com clorofórmio e/ou metanol, utilizando pipetas de vidro borossilicato para estas etapas, e enxaguando essas pipetas com clorofórmi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos de centrífuga de vidro de alta velocidade de 15 mL com tampas revestidas de Teflon	PYREX	05-550
Frascos de amostra de vidro de 2 mL com tampas revestidas de Teflon	Fisher Scientific	60180A-SV9-1P
2-Propanol	Fisher Scientific	A461-500
Acetonitrila	Fisher Scientific	A9554
Agilent 1100 series LC system	Agilent Tecnologias	G1312A
Agilent1100 Wellplate	Agilent Technologies	G1367A
Acetato de amônio	Fisher Scientific	A11450
Bicarbonato de amônio	Sigma	9830
Formato de amônio	Fisher Scientific	A11550
Hidróxido de amônio	Fisher Scientific	A470-250
Bactopeptona	Fisher Scientific	BP1420-2
Cardiolipina	Avanti Lipídios Polares	750332
Centrífuga clínica Centra CL2	Thermo Scientific	004260F
Ceramida	Avanti Lipídios Polares	860517
Clorofórmio	Fisher Scientific	C297-4
CSH C18 VanGuard	Sistema	de	pré-coluna
Ácido graxo livre (19:0)	Matreya	1028
Contas de vidro (lavadas com ácido, 425-600 μ M)	Sigma-Aldrich	G8772
Glicose	Fisher Scientific	D16-10
Hemacitômetro	Fisher Scientific	267110
L< / em>-histidina	Sigma	H8125
Software de pesquisa lipídica (V4.1)	Fisher Scientific	V4.1	LC-MS / MS
L< / em>-leucina	Sigma	L8912
L-lisina	Sigma	L5501
Metanol	Fisher Scientific	A4564
Fosfatidilcolina	Avanti Lipídios Polares	850340
Fosfatidiletanolamina	Avanti Lipídios Polares	850704
Fosfatidilglicerol	Avanti Lipídios Polares
Fosfatidilinositol	Avanti Lipídios Polares	LM1502
Fosfatidilserina	Avanti Lipídios Polares	840028
Coluna de fase reversa CSH C18	Águas	186006102
Esfingosina	Avanti Lipídios Polares	860669
Thermo Orbitrap Velos MS	Fisher Scientific	ETD-10600
Tricilglicerol	Larodan, Malmo	TAG Misturado FA
Sonicador ultrassônico	Fisher Scientific	15337416
Uracil	Sigma	U0750
Vortex	Fisher Scientific	2215365
Extrato de levedura	Fisher Scientific	BP1422-2
Base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos	Fisher Scientific	DF0919-15-3
Cepa de levedura BY4742	Dharmacon	YSC1049