सचारोमाइसेस सेरेविसी के सेलुलर लिपिडोम का मात्रात्मक विश्लेषण टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर तरल क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके
Summary
हम सचारोमाइसेस सेरेविसियामें प्रमुख सेलुलर लिपिड की पहचान करने और उसकी मात्रा निर्धारित करने के लिए मिलकर द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर तरल क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। खमीर कोशिका के भीतर प्रमुख लिपिड कक्षाओं के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए वर्णित विधि बहुमुखी, मजबूत और संवेदनशील है।
Abstract
लिपिड संरचनात्मक रूप से विविध एम्फीपैथिक अणु हैं जो पानी में अघुलनशील हैं। लिपिड जैविक झिल्ली, ऊर्जा भंडारण और उत्पादन, सेलुलर सिग्नलिंग, प्रोटीन के वेसिकुलर परिवहन, ऑर्गेनेल बायोजेनेसिस और विनियमित सेल डेथ के संगठन और कार्य में आवश्यक योगदानकर्ता हैं। क्योंकि नवोदित खमीर सैचारोमाइसेस सेरेविसिया पूरी तरह से आणविक विश्लेषण करने के लिए एक एकएककोशिकीय यूकेरियोट उत्तरदायी है, एक मॉडल जीव के रूप में इसके उपयोग ने लिपिड मेटाबोलिज्म और इंट्रासेलुलर परिवहन को यूकेरियोटिक कोशिकाओं के भीतर जटिल जैविक प्रक्रियाओं को जोड़ने वाले तंत्र को उजागर करने में मदद की। खमीर कोशिका के भीतर लिपिड के प्रमुख वर्गों के मजबूत, संवेदनशील और सटीक मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए एक बहुमुखी विश्लेषणात्मक विधि की उपलब्धता इन तंत्रों में गहरी अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। यहां हम एस सेरेविसिया के प्रमुख सेलुलर लिपिड के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस/एमएस) के साथ मिलकर तरल क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । एलसी-एमएस/एमएस विधि वर्णित बहुमुखी और मजबूत है । यह 10 लिपिड कक्षाओं में से प्रत्येक के भीतर कई प्रजातियों (विभिन्न आइसोबेरिक या आइसोमिक रूपों सहित) की पहचान और मात्रा को सक्षम बनाता है। यह विधि संवेदनशील है और सांद्रता पर कुछ लिपिड प्रजातियों की पहचान और मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देती है, जो ०.२ pmol/μL के रूप में कम है । विधि सफलतापूर्वक पूरे खमीर कोशिकाओं और उनके शुद्ध ऑर्गेनेल्स के लिपिडोम्स का आकलन करने के लिए लागू किया गया है। इस विधि में इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए वैकल्पिक मोबाइल चरण योजक का उपयोग कुछ लिपिड प्रजातियों के लिए आयनीकरण की दक्षता को बढ़ा सकता है और इसलिए इसका उपयोग उनकी पहचान और मात्रा में सुधार करने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
साक्ष्य का एक शरीर इंगित करता है कि लिपिड, जैव अणुओं के प्रमुख वर्गों में से एक, एक यूकेरियोटिक सेल के भीतर कई महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं में आवश्यक भूमिकानिभाते हैं। इन प्रक्रियाओं में लिपिड बाइलेयर की असेंबली शामिल है जो सेलुलर ऑर्गेनेल्स के आसपास प्लाज्मा झिल्ली और झिल्ली का गठन करती है, कोशिका झिल्ली में छोटे अणुओं का परिवहन, बाह्य वातावरण और इंट्राकोशियलर सिग्नल ट्रांसड्यूक्शन में परिवर्तन के लिए प्रतिक्रिया, ऊर्जा का उत्पादन और भंडारण, विभिन्न ऑर्गेनेल्स तक सीमित प्रोटीन का आयात और निर्यात, एंडोम्ब्रेनिक सिस्टम और प्रोटीन स्राव के भीतर प्रोटीन की वैसिकुलर तस्करी, और कई मोड ,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
नवोदित खमीर एस cerevisiae,एक एकही सेलुलर यूकेरियोटिक जीव, सफलतापूर्वक इन महत्वपूर्ण सेलुलरप्रक्रियाओं4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 में लिपिड की आवश्यक भूमिकाओं अंतर्निहित तंत्र में से कुछ को उजागर करने के लिए इस्तेमाल किया गया है ,16,17,18,19,20. एस सेरेविसिया इन तंत्रों को उजागर करने के लिए एक मूल्यवान मॉडल जीव है क्योंकि यह व्यापक जैव रासायनिक, आनुवंशिक, कोशिका जैविक, रासायनिक जैविक, प्रणाली जैविक और माइक्रोफ्लूइडिक विच्छेदन के लिए उत्तरदायी है21,22,23,24,25का विश्लेषण करता है। तंत्र को समझने में आगे प्रगति जिसके माध्यम से लिपिड चयापचय और इंट्रासेलर परिवहन इन महत्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रियाओं में योगदान सेलुलर लिपिडोम के मात्रात्मक लक्षण वर्णन के लिए संवेदनशील जन स्पेक्ट्रोमेट्री प्रौद्योगिकियों की आवश्यकता है, लिपिडोम आणविक जटिलता को समझना, और मात्रात्मक लिपिडोमिक्स को सिस्टम जीव विज्ञान1,2,3,26के बहुविषयक मंच में एकीकृतकरना, 27,28,29,30.
खमीर कोशिकाओं और अन्य यूकेरियोटिक जीवों की कोशिकाओं के द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री-असिस्टेड क्वांटिटेटिव लिपिडोमिक्स के लिए वर्तमान तरीके पर्याप्त रूप से बहुमुखी, मजबूत या संवेदनशील नहीं हैं। इसके अलावा, वर्तमान में उपयोग किए जाने वाले ये तरीके विभिन्न आइसोबेरिक या आइसोमरिक लिपिड प्रजातियों को एक दूसरे से अलग करने में असमर्थ हैं। यहां हम एक बहुमुखी, मजबूत और संवेदनशील विधि का वर्णन करते हैं जो एस सेरेविसीके प्रमुख सेलुलर लिपिड के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस/एमएस) के साथ मिलकर तरल क्रोमेटोग्राफी के उपयोग की अनुमति देता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
निम्नलिखित सावधानियां यहां वर्णित प्रोटोकॉल के सफल कार्यान्वयन के लिए महत्वपूर्ण हैं:
1. क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल विषाक्त होते हैं। वे कुशलता पूर्वक सतहों से विभिन्न पदार्थों को निकालते हैं, …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम चर्चाओं के लिए टिटोर्को प्रयोगशाला के वर्तमान और पूर्व सदस्यों के आभारी हैं । हम उत्कृष्ट सेवाओं के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री के जैविक अनुप्रयोगों और सेंटर फॉर स्ट्रक्चरल एंड फंक्शनल जीनोमिक्स (कॉनकोर्डिया विश्वविद्यालय में दोनों) को स्वीकार करते हैं। इस अध्ययन को कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (एनएसईआरसी) (आरजीपिन 2014-04482) और कॉनकोर्डिया विश्वविद्यालय चेयर फंड (CC0113) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । केएम को कॉनकोर्डिया यूनिवर्सिटी मेरिट अवार्ड का समर्थन मिला ।
Materials
| 15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| 2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A461-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Agilent1100 Wellplate | Agilent Technologies | G1367A | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A470-250 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Ceramide | Avanti Polar Lipids | 860517 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| CSH C18 VanGuard | Waters | 186006944 | Pre-column system |
| Free fatty acid (19:0) | Matreya | 1028 | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μM) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| Lipid Search software (V4.1) | Fisher Scientific | V4.1 | LC-MS/MS analysis software |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 850340 | |
| Phosphatidylethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850704 | |
| Phosphatidylglycerol | Avanti Polar Lipids | 840446 | |
| Phosphatidylinositol | Avanti Polar Lipids | LM1502 | |
| Phosphatidylserine | Avanti Polar Lipids | 840028 | |
| Reverse-phase column CSH C18 | Waters | 186006102 | |
| Sphingosine | Avanti Polar Lipids | 860669 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Tricylglycerol | Larodan, Malmo | TAG Mixed FA | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Fisher Scientific | DF0919-15-3 | |
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 |
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