탠덤 질량 분석과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로 미세화세세비시아의 세포 지질의 정량분석
Summary
우리는 Saccharomyces cerevisiae에있는 중요한 세포 지질을 확인하고 정량화하기 위하여 탠덤 질량 분광법과 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 프로토콜을 제시합니다. 효모 세포 내의 주요 지질 클래스의 정량적 평가를 위한 설명된 방법은 다재다능하고, 견고하며, 민감하다.
Abstract
지질은 물에서 불용성 구조적으로 다양한 양과 성 분자입니다. 지질은 생물학적 막의 조직과 기능에 필수적인 기여자, 에너지 저장 및 생산, 세포 신호, 단백질의 포식 수송, 세포 생체 발생, 및 조절 된 세포 사멸. 신진 효모 Saccharomyces cerevisiae는 철저한 분자 분석을 할 수 있는 단세포 진핵생물이기 때문에, 모형 유기체로 의 사용은 진핵 세포 내의 복잡한 생물학 프로세스에 지질 물질 대사 및 세포내 수송을 연결하는 기계장치를 밝히는 것을 도왔습니다. 효모 세포 내의 주요 지질 류의 강력하고 민감하며 정확한 정량적 평가를 위한 다목적 분석 방법의 가용성은 이러한 메커니즘에 대한 깊은 통찰력을 얻는 데 매우 중요합니다. 여기에서 우리는 S. cerevisiae의 주요 세포 지질의 정량 분석을 위한 탠덤 질량 분석법 (LC-MS/MS)와 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하는 프로토콜을 제시합니다. 설명된 LC-MS/MS 방법은 다재다능하고 견고합니다. 그것은 10 개의 지질 클래스의 각각 내에서 수많은 종 (다른 등심 또는 이소성 형태 포함)의 식별 및 정량화를 가능하게합니다. 이 방법은 민감하고 0.2 pmol /μL의 낮은 농도에서 일부 지질 종의 식별 및 정량을 허용합니다. 이 방법은 전체 효모 세포와 정제 된 소기관의 지질 을 평가하는 데 성공적으로 적용되었습니다. 이 방법에서 전기 분무 이온화 질량 분광법에 대한 대체 이단 첨가제의 사용은 일부 지질 종에 대한 이온화의 효율을 증가시킬 수 있으며 따라서 그들의 식별 및 정량을 향상시키는 데 사용될 수 있다.
Introduction
증거의 몸은 지질, 생체 분자의 주요 클래스 중 하나, 진핵 세포 내에서 많은 중요한 프로세스에 필수적인 역할을 나타냅니다. 이러한 프로세스는 세포 소기관을 둘러싼 혈장 막과 막을 구성하는 지질 이중층의 조립, 세포막을 가로지르는 소분자의 수송, 세포외 환경및 세포내 신호 전이의 변화에 대한 반응, 에너지의 생성 및 저장, 다른 세포기관에 국한된 단백질의 생성 및 수출, 내막 시스템 및 단백질 분비내의 단백질의 반응 인신매매, 여러 세포 세포 분비, 및 단백질 분비의 수강용 인신, 및 여러 세포 세포 내 단백질의 인신 매매를포함합니다. 2,3,4,5,6,7,8,9,10.
신생 효모 S. cerevisiae,단세포 진핵 생물, 성공적으로 이러한 중요한 세포 과정에서 지질의 필수 역할의 기초메커니즘의 일부를 발견하는 데 사용되었습니다4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae는 포괄적인 생화학적, 유전적, 세포 생물학적, 화학적 생물학적, 시스템 생물학적, 및 미세유체 해부 분석21,22,23,24,25를사용할 수 있기 때문에 이러한 메커니즘을 밝히는 귀중한 모델 유기체이다. 지질 대사와 세포내 수송이 이러한 중요한 세포 과정에 기여하는 이해 메커니즘의 추가 진전은 세포 지질의 정량적 특성화에 대한 민감한 질량 분석 기술을 필요로하며, 지질학 분자 복잡성을 이해하고, 정량적 지질학을 시스템 생물학1,2,3,26의다분야 플랫폼으로 통합합니다. 27,28,29,30.
다른 진핵 생물의 효모 세포 및 세포의 질량 분광법 보조 양적 지질학에 대한 현재 의 방법은 충분히 다재다능하거나, 견고하거나, 민감하지 않다. 더욱이, 이들 현재 사용되는 방법은 서로 다양한 등바성 또는 이소성 지질 종을 분화할 수 없다. 여기에서 우리는 S. cerevisiae의주요 세포 지질의 정량 분석을 위한 탠덤 질량 분석법 (LC-MS/MS)와 결합된 액체 크로마토그래피의 사용을 허용하는 다재다능하고, 견고하고, 민감한 방법을 기술합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 프로토콜을 성공적으로 구현하는 데 는 다음과 같은 예방 조치가 중요합니다.
1. 클로로포름과 메탄올은 독성이 있습니다. 실험실 플라스틱 제품 및 피부를 포함한 표면에서 다양한 물질을 효율적으로 추출합니다. 따라서 이러한 유기 용매는 클로로포름 및/또는 메탄올과 접촉하는 단계에서 플라스틱을 사용하지 않고, 이러한 단계에 보로실리케이트 유리 파이…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 토론을 위해 Titorenko 실험실의 현재 및 전 회원에게 감사드립니다. 우리는 질량 분석의 생물학적 응용 을위한 센터와 구조 및 기능 유전체학 센터 (모두 콩코르디아 대학에서) 뛰어난 서비스를 인정합니다. 이 연구는 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC)의 보조금에 의해 지원되었다 (RGPIN 2014-04482) 콩코르디아 대학 의자 기금 (CC0113). K.M.은 콩코르디아 대학 공로상을 수상했습니다.
Materials
| 15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| 2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A461-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Agilent1100 Wellplate | Agilent Technologies | G1367A | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A470-250 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Ceramide | Avanti Polar Lipids | 860517 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| CSH C18 VanGuard | Waters | 186006944 | Pre-column system |
| Free fatty acid (19:0) | Matreya | 1028 | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μM) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| Lipid Search software (V4.1) | Fisher Scientific | V4.1 | LC-MS/MS analysis software |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 850340 | |
| Phosphatidylethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850704 | |
| Phosphatidylglycerol | Avanti Polar Lipids | 840446 | |
| Phosphatidylinositol | Avanti Polar Lipids | LM1502 | |
| Phosphatidylserine | Avanti Polar Lipids | 840028 | |
| Reverse-phase column CSH C18 | Waters | 186006102 | |
| Sphingosine | Avanti Polar Lipids | 860669 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Tricylglycerol | Larodan, Malmo | TAG Mixed FA | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Fisher Scientific | DF0919-15-3 | |
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 |
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