In Vivo Infectie met Leishmania amazonensis om parasiet virultie in muizen te evalueren

Summary

Hier presenteren we een samengesteld protocol om de cutane infectie van muizen met Leishmania amazonensiste evalueren. Dit is een betrouwbare methode voor het bestuderen van parasietvirulentie, waardoor een systemische weergave van de gewervelde gastheer respons op de infectie.

Abstract

Leishmania spp. zijn protozoan parasieten die leishmaniases veroorzaken, ziekten die een breed spectrum van klinische manifestaties van cutane tot viscerale laesies presenteren. Momenteel, 12 miljoen mensen worden geschat te zijn besmet met Leishmania wereldwijd en meer dan 1 miljard mensen leven op het risico van infectie. Leishmania amazonensis is endemisch in Midden- en Zuid-Amerika en leidt meestal tot de cutane vorm van de ziekte, die direct kan worden gevisualiseerd in een diermodel. Daarom zijn L. amazonensis stammen goede modellen voor cutane leishmaniasis studies omdat ze ook gemakkelijk worden gekweekt in vitro. C57BL/6 muizen bootsen de L. amazonensis-gedrevenziekteprogressie na die bij mensen wordt waargenomen en worden beschouwd als een van de beste muizenstammenmodel voor cutane leishmaniasis. In de gewervelde gastheer bewonen deze parasieten macrofagen ondanks de afweermechanismen van deze cellen. Verschillende studies gebruiken in vitro macrofaag infectie testen om de parasiet infectiviteit te evalueren onder verschillende omstandigheden. De in vitro benadering is echter beperkt tot een geïsoleerd celsysteem dat de reactie van het organisme negeert. Hier compileren we een in vivo murineinfectiemethode die een systemisch fysiologisch overzicht biedt van de interactie tussen gastheer en parasiet. Het gedetailleerde protocol voor de in vivo infectie van C57BL/6 muizen met L. amazonensis omvat parasietdifferentiatie in besmettelijke amastigoten, muizen voetpad cutane inenting, laesie ontwikkeling, en parasiet belasting bepaling. Wij stellen deze gevestigde methode voor als de meest geschikte methode voor fysiologische studies van de gastheer immuun- en metabole reacties op cutane leishmaniasis.

Introduction

Leishmaniases zijn wereldwijd voorkomende parasitaire infectieziekten die belangrijke uitdagingen in ontwikkelingslanden vertegenwoordigen en worden door de Wereldgezondheidsorganisatie^1,2erkend als een van de belangrijkste verwaarloosde tropische ziekten. De leishmaniasen worden gekenmerkt door cutane, slijmvlies, en / of viscerale manifestaties. Cutane leishmaniasis wordt meestal veroorzaakt door L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica en L. aethiopica³. Deze vorm van de ziekte is vaak zelfherstellend bij de mens als gevolg van de inductie van beschermende cellulaire immuunrespons. Echter, de cellulaire immuunrespons kan mislukken, en de ziekte kan vooruitgang boeken om te verspreiden cutane leishmaniasis^4,5. Er is geen vaccin beschikbaar vanwege de diversiteit onder Leishmania soorten en gastheer genetische achtergronden^6,7. Behandelingsopties zijn ook beperkt omdat de meeste momenteel beschikbare geneesmiddelen duur, giftig en/of langdurige behandeling vereisen^8,9. Bovendien zijn er meldingen van resistentie tegen geneesmiddelen tegen de beschikbare behandelingen^10,11.

De veroorzaker van leishmaniases is de protozoan parasiet Leishmania. De parasiet presenteert twee verschillende morfologische vormen in zijn levenscyclus: promastigoten, de flagellated vorm gevonden in zandvliegen; en amastigoten, de intracellulaire vorm gevonden in de parasitophoreuze vacuoles van de zoogdiergastheer macrofagen^12,13. Amastigotes ‘ vermogen om binnen te vallen, overleven, en repliceren, ondanks de verdediging mechanismen van de gewervelde gastheer macrofagen zijn onderworpen aan vele studies^14,15,16,17. Bijgevolg hebben verschillende onderzoeksgroepen in vitro macrofaaginfectietests beschreven om de impact van specifieke omgevingsfactoren te evalueren, evenals parasiet- en gastheergenen op infectiviteit van parasieten. Deze test biedt verschillende voordelen, zoals het vermogen om studies aan te passen aan een hoog doorvoerformaat, een relatief kortere periode om resultaten te verkrijgen en een verminderd aantal geofferde proefdieren¹⁸. De bevindingen van in vitro tests zijn echter beperkt omdat ze niet altijd repliceren in vivo studies^14,19,20,21. In vivo testen bieden een systemisch fysiologisch overzicht van de host-parasiet interactie, die niet volledig kan worden nagebootst door in vitro testen. Immunologische studies kunnen bijvoorbeeld worden uitgevoerd door middel van immunohistochemische testen van verzamelde delen van het voetpadweefsel of zelfs van popliteale lymfeklieren voor analyse van de teruggewonnen immuuncellen²².

Dieren worden vaak gebruikt als model voor menselijke ziekten in biologisch en biomedisch onderzoek om de onderliggende fysiologische mechanismen van de ziekten beter te begrijpen²³. In het geval van leishmaniasis beïnvloedt de route, de plaats of de dosis inenting de uitkomst van de ziekte^24,25,26,27. Bovendien worden de gevoeligheid en de weerstand tegen de infectie bij mensen en muizen sterk gereguleerd door de genetische achtergronden van de gastheer en parasiet^{4,5,22,28,29,30,31}. BALB/c muizen zijn zeer gevoelig voor L. amazoneensinfectie, die een snelle ziekteprogressie vertonen met de verspreiding van de parasieten naar de lymfeklieren, milt en lever³². Aangezien de ziekte kan vorderen tot cutane metastasen, kan de infectie fataal zijn. C57BL/6 muizen ontwikkelen daarentegen vaak chronische laesies met aanhoudende parasietbelastingen in L. amazonensis-infectie assays³³. Daarbij, L. amazonensis infectie met deze bijzondere muissoort is beschouwd als een uitstekend model om chronische vormen van cutane leishmaniasis bij de mens te bestuderen, omdat het bootst de ziekte progressie beter dan de BALB / c muizen infectie model^5,34.

Daarom stellen we voor dat de murine in vivo infectie een nuttige methode is voor Leishmania virulentie fysiologische studies die van toepassing zijn op de menselijke ziekte, waardoor een systemisch beeld van de interactie tussen gastheer en parasiet mogelijk is. Herbezoeken gevestigde assays²², presenteren we hier een gecompileerde stap-voor-stap protocol van de in vivo infectie van C57BL / 6 muizen met L. amazonensis die de parasiet differentiatie in axenic amastigotes, muizen voetpad cutane inenting, laesie ontwikkeling, en parasiet belasting bepaling omvat. Dit protocol kan worden aangepast aan andere muizenstammen en Leishmania soorten die cutane leishmaniases veroorzaken. Tot slot, de hier gepresenteerde methode is cruciaal bij het identificeren van nieuweanti-Leishmania drug doelen en vaccins, evenals in fysiologische studies van de gastheer immuun en metabole reacties op Leishmania infectie.

Protocol

Alle experimentele procedures zijn goedgekeurd door het Comité voor dierenwelzijn en gebruik van het Instituut voor Biowetenschappen van de Universiteit van São Paulo (CEUA 342/2019), en werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen en het beleid voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van de staat São Paulo (Lei Estadual 11.977, de 25/08/2005) en de Braziliaanse regering (Lei Federal 11.794, de 08/10/2008). Alle stappen beschreven in secties 1-5 moeten aseptisch worden uitgevoerd in laminaire st…

Representative Results

Leishmania protozoan parasieten bestaan in twee ontwikkelingsvormen tijdens hun levenscyclus in ongewervelde en gewervelde gastheren: promastigoten, de proliferative vormen gevonden in het lumen van de vrouwelijke zandvlieg; en amastigoten, de proliferative vormen gevonden in de parasitophoreuze vacuoles van de zoogdiergastheercellen. Promastigoten hebben een langwerpig lichaam van ongeveer 1,5 μm breed en 20 μm lang, met een flagellum die meestal uit de voorste extremiteit tev…

Discussion

De in vivo infectietest beschreven in dit protocol stelt elke onderzoeker in staat om in vivo cutane leishmaniasis te evalueren, gezien de interactie tussen gastheer en parasiet in een systemisch scenario. Deze tests zijn gebruikt door vele groepen^{22,24,27,29,31,32,34,}<sup class="…

Materials

96-well plate	Greiner bio-ne	655180	A flat-bottom plate for limiting dilution assay
adenine	Sigma	A8626	Supplement added to M199 cell culture media
caliper	Mitutoyo	700-118-20	A caliper to measure the thickness of footpad
cell culture flask	Corning	353014	A 25 cm2 volume cell culture flask to cultivate Leishmania parasite
centrifuge	Eppendorf	5804R	An equipament used for separating samples based on its density
CO2 incubator 34 °C	Thermo Scientific	3110	An incubator for amastigotes differentiation
ethanol	Merck	K50237083820	A disinfectant for general items
fetal bovine serum	Gibco	12657-029	Supplement added to M199 cell culture media
glass tissue grinder tube	Thomas Scientific	3431 E04	A tube to collect and disrupt infected footpad tissue
glucose	Synth	G1008.01.AH	Supplement added to M199 cell culture media
GraphPad Prism Software	GraphPad		A software used to plot the data and calculate statistical significance
hemin	Sigma	H-2250	Supplement added to M199 cell culture media
HEPES	Promega	H5303	Supplement added to M199 cell culture media
incubator 25 °C	Fanem	347CD	An incubator for promastigotes cultivation
inverted microscope	Nikon	TMS	An equipament used to visual analyze the promastigote and amastigote cultures
isoflurane			An inhalant anesthetics for mice (3-5%)
laminar flow cabinet	Veco	VLFS-09	A biosafety cabinet used for aseptical work area
M199 cell culture media	Gibco	31100-035	A cell culture media for Leishmania cultivation
microcentrifuge tube	Axygen	MCT150C	A microtube used for sample collection, processing and storage
multichanel pipette	Labsystems	F61978	A multichannel pipette used for limiting dilution assay
NaHCO3	Merck	6329	Supplement added to M199 cell culture media
NaOH	Sigma	S8045	Supplement added to M199 cell culture media
Neubauer chamber	HBG	2266	A hemocytometer to count the parasite suspension
optical microscope	Nikon	E200	An optical equipament used to count parasite
parafilm	Bemis	349	A flexible and resistant plastic to seal the plate
penicillin/streptomycin	Gibco	15140122	Supplement added to M199 cell culture media
Petri dishes	TPP	93100	A sterile dish to dissect the footpad tissue
pipetman kit	Gilson	F167360	A micropipette kit containing four pipettors (P2 P20 P200 P1000)
scale	Quimis	BG2000	An equipament used to weigh collected footpad lesions
scalpel	Solidor	10237580026	A scalpel to cut and collect footpad tissue
serological pipette 10 mL	Nest	327001	A sterile pipette used for transfering mililiter volumes
tips	Axygen		A pipette tip used for transfering microliter volumes
Trypan blue	Gibco	15250-061	A dye used to count viable parasites
trypticase peptone	Merck		Supplement added to M199 cell culture media
tuberculin syringe	BD	305945	A syringe with 27G needle to inoculate the parasite suspension