Denne protokol beskriver den kirurgiske generation af ortotopiske pancreastumorer og den hurtige fordøjelse af frisk isolerede murine pancreas tumorer. Efter fordøjelsen kan levedygtige immuncelle populationer anvendes til yderligere downstream-analyse, herunder ex vivo -stimulering af T-celler til intracellulær cytokindetektion ved strømnings cytometri.
In vivo modeller af kræft i bugspytkirtlen giver uvurderlige værktøjer til at studere sygdoms dynamik, immun infiltration og nye terapeutiske strategier. Den ortotopiske murine model kan udføres på store kohorter af immunkompetente mus samtidigt, er relativt billig og bevarer det hyggelige vævs mikromiljø. Kvantificeringen af T-celleinfiltration og cytotoksisk aktivitet inden for ortotopiske tumorer giver en nyttig indikator for en antitumoralsk respons.
Denne protokol beskriver metoden til kirurgisk generering af ortotopiske tumorer i bugspytkirtlen ved injektion af et lavt antal syngeneiske tumorceller ophængt i 5 μL kælder membran direkte ind i bugspytkirtlen. Mus, der bærer ortotopiske tumorer tage cirka 30 dage at nå endepunkt, på hvilket tidspunkt tumorer kan høstes og forarbejdes til karakterisering af tumor-infiltrerende T celle aktivitet. Hurtig enzymatisk fordøjelse med kollagenase og DNase gør det muligt at udtrække en enkelt cellesuspension fra tumorer. Levedygtigheden og celleoverfladen markører af immunceller ekstraheret fra tumoren bevares; Derfor er det hensigtsmæssigt for flere downstream-applikationer, herunder flow-assisteret celle sortering af immunceller til kultur eller RNA ekstraktion, flow flowcytometri analyse af immuncelle populationer. Her beskriver vi ex vivo -stimulering af T-cellepopulationer for intracellulær cytokinkvantificering (IFNγ og TNFα) og degranulations aktivitet (CD107a) som et mål for samlet cytotoksicitet. Hele-tumor fordøjelser blev stimuleret med phorbols myristate acetat og ionomycin for 5 h, i nærværelse af anti-CD107a antistof for at upregulate cytokin produktion og degranulering. Tilsætning af brefeldin A og monensin til den sidste 4 h blev udført for at blokere ekstracellulær transport og maksimere cytokindetektion. Der blev derefter udført ekstra-og intra-cellulær farvning af celler for flowcytometri-analyse, hvor andelen af IFNγ+, tnfα+ og CD107a+ CD4+ og CD8+ T-celler blev kvantificeret.
Denne metode giver en start base til at udføre omfattende analyse af tumor mikromiljø.
Denne metode detaljer, fra start til, den kirurgiske procedure for at generere ortotopiske bugspytkirtel tumorer ved hjælp af en minimal mængde af cellulære materiale og den efterfølgende hurtig dissociation af etablerede tumorer for omfattende flow flowcytometri analyse af immunceller populationer, herunder ex vivo analyse af T celle funktion.
Pancreatisk duktalt adenokarcinom (pdac) er en aggressiv karcinom med kun 8% af patienterne overlever 5 år1. Da mindre end 20% af patienterne er berettiget til kirurgisk resektion2, er friske patientprøver ikke umiddelbart tilgængelige for forskning, og derfor indeholder in vivo -modeller væsentlige værktøjer til at undersøge denne sygdom. Der er flere murine modeller af PDAC: orthotopic, subkutane, transgene, intravenøs og patient-afledte xenograft (PDX), udførligt beskrevet her3. Den ortotopiske model, der er beskrevet her, tillader injektion af syngeneiske PDAC-celler i bugspytkirtlen af immunkompetente mus. Dette kan udføres i store kohorter af vilde-type eller mutant mus, og dermed giver en omkostningseffektiv og konsekvent model for sammenligning af terapeutiske agenser. Vigtigere, den ortotopisk model giver den cognate mikromiljø for tumorcellevækst og metastastørrelserne i vores hænder og andre4 til klinisk relevante steder (f. eks, leveren), hvilket gør det mere klinisk relevant end de subkutane eller kemisk inducerede modeller. Orthotopic tumorer vise nøglefunktioner i PDAC, såsom en stærk desmoplastisk reaktion med en overflod af fibroblaster og ekstracellulære matrix deposition5. Transgene modeller af PDAC er guldstandarden for murine model og den mest almindeligt anvendte er KPC model, som udtrykker mutant KrasG12D/+ og Trp53R172H/+ under den bugspytkirtel-specifikke PDX-1-CRE Promoter6. Yderligere KPC og andre in vivo pdac modeller gennemgås her7. KPC-mus udvikler spontant pancreastumorer med en sygdomsprogression, der trofast replikater funktioner i humant PDAC6. Men som for alle transgene modeller, avlsprogrammet er dyrt, tumorprogression er variabel og derfor ofte kræver store kohorter af mus. PDX modeller bruger patient-afledte tumorceller eller stykker, som derefter dyrkes enten ortootopisk eller oftere subkutant i immunkompromitterede mus. Xenograft-modeller giver nyttige værktøjer til screening af terapeutiske forbindelser og tegner til patientens heterogenitet. Men, de giver ikke en komplet immun mikromiljø, og dermed begrænse deres applikationer8,9.
Når etableret, ortotopisk tumorer typisk tage omkring 1 måned eller mere for at vokse (afhængigt af den anvendte cellelinje) og danne store tumorer, der kan let afbildet af ultralyd eller MRI til at spore progression og bestemme behandlingens virkning4,5,10. Men, en gang i eksponentiel vækst, den sidste fase af tumorvækst kan være hurtig, så de fleste behandlingsregimer er påbegyndt relativt tidligt (f. eks 14 dage)11,12. Immunsystemet spiller en afgørende rolle i tumor udvikling, herunder i pdac, som er karakteriseret ved en immunsuppressiv tumor infiltrere med relativ Brandt af T-celler og hyppig tilstedeværelse af myeloide celler13. En høj forekomst af T-celler i pdac giver en bedre prognose14,15. Men, som enkelt agenter, immun check point hæmmere at lindre T celle immunsuppression, såsom anti-CTLA-416 og anti-PD-L117, har ikke vist klinisk fordel hos pdac patienter, sandsynligvis fordi den samlede T celle reaktivitet er meget lav. Men, agenter, der Prime T celle respons, såsom anti-CD40, kan overvinde anti-PD-L1/ctla-4 modstand18,19 og vaccination med GM-CSF-udskilning allogen pdac vaccine (gvax) kan øge immunogeniciteten af pdac tumorer20, hvilket indikerer, at øge T celle svar danner vigtige terapeutiske Avenue.
Kritisk til en antitumoral T celle respons er anerkendelsen af tumor-afledte antigener via T-celle receptor (TCR) og den efterfølgende produktion af cytotoksiske cytokiner og granulat. Mens T-celle antigen-anerkendelse kan bestemmes ved TCR sekvensering, denne tilgang er dyrt og tidskrævende. Kvantificering af tumor infiltrerende T-celle undersæt giver imidlertid en god indikation af en anti-tumoralsk respons. Yderligere undersøgelse af T-cellens aktivitet ex vivo med hensyn til degranulering, cytokinproduktion og andre cytotoksiske faktorer giver en dybere funktionel analyse. Disse assays kan udføres på friske tumorprøver og mange parametre af T celle funktion kan måles hurtigt ved flow cytometry.
CD8+ og CD4+ T- celler producerer cytokiner såsom Ifnγ og tnfα for at forstærke immunresponset21. IFNɣ inducerer mhci docetaxels Opregulering på målceller, inducerer differentiering og rekruttering af immunceller og aids celledød. Ifnγ produktion af CD8+ T celler er velkarakteriseret at være en del af en antitumoral respons og korrelerer med tumorregression22,23. TNFα er en anden proinflammatorisk cytokin, der produceres af både CD8+ og CD4+ T- celler. Det forbedrer TCR-afhængige aktivering og spredning af T-celler, medvirken den anti-tumoral respons. Ved TCR-engagement kan cytotoksiske CD8+ T- celler gennemgå degranulering, hvor præ-dannede sekretoriske lysosomer, der indeholder cytotoksiske molekyler, frigives til den immunologiske synapse for at forårsage nedbrydning af målcellerne21. Disse molekyler omfatter Perforin, et protein, der binder sig til målcellens membran, danner porer, der derefter forstyrrer membran integriteten og tillader diffusion21 eller endocytose24 af andre cytotoksiske molekyler, såsom granzyme B, direkte ind i cytoplasmaet i målcellen. Granzyme B er en proteasehæmmere, der indvirker nedbrydningen af flere proteiner i målcellen, hvilket fører til celledød21. Frigivelsen af sådanne molekyler kræver exocytose af endosomer til cellens overflade, hvor endosomal markør CD107a (også kendt som lampe-1) er transitivt indarbejdet i cellemembranen25.
Måling af cytokinsekretion med T-celler kræver, at de isoleres ved hjælp af enten flow assisteret celle sortering eller perle baserede separations analyser, som ikke let kan udføres på et stort antal prøver samtidigt. Imidlertid kræver måling af intracellulære cytokiner ikke nogen præ-isolations trin og kan let udføres på flere prøver på én gang, hvilket muliggør en tilgang med højere gennemløb. Da cytokiner hurtigt udskilles af T-celler, kan de intracellulære niveauer være målbart, og derfor kræver T-cellen stimulering for at øge basal cytokinproduktionen. For at vurdere antigen drevet cytokinproduktion skal det antigen, der anerkendes af TCR, frembydes for T-cellen af en primet APC in vitro. I tilfælde, hvor antigen specificiteten ikke er kendt, er der behov for en bred stimulerings metode. TCR stimulation kan efterlignes ved hjælp af anti-CD3/28 perler, der giver både TCR aktivering og costimulation, som inducerer cytokin produktion og spredning. Et mere omkostningseffektivt alternativ er imidlertid brugen af PMA og ionomycin, som tilsammen aktiverer signalerings veje, der fører til syntese og frigivelse af intracellulære cytokiner. Specifikt, PMA aktiverer protein kinase C (PKC) og ionomycin rejser intracellulære ca2 + ioner, hvilket fører til øget celle signalering. For at bevare intracellulært indhold af cytokiner, denne stimulation kan effektivt kombineres med protein-transport hæmmere brefeldin A og monensin, som blokerer proteiner i Golgi og dermed forhindre ekstracellulære frigivelse. Brugen af PMA/ionomycin er en veletableret metode til stimulering af T-celler, og der er en stærk sammenhæng mellem ekstracellulære-frigivne og intracellulære cytokiner26. Stimulering af T-celler med PMA og ionomycin øger også lysosomhandelen til cellemembranen og dermed bliver CD107a transitivt integreret på cellens overflade, inden den genbruges i cellen. Ved at medtage et anti-CD107a antistof under stimuleringen er det muligt at bruge det som markør for degranulations aktivitet25.
Denne metode hurtigt fordøjer tumorer til at give en enkelt cellesuspension. På dette tidspunkt kan individuelle populationer direkte farves for strømnings cytometri eller renses ved downstream-metoder: flow-assisteret celle sortering eller magnetisk-perle adskillelse. Fremstilling af en enkelt cellesuspension til flow cytometri analyse giver en høj gennemløb analyse af flere immunceller populationer og deres fænotypiske markører, giver en nøjagtig kvantificering af immuncelle nummer og fænotype.
Endelig, den fordøjelse protokol beskrevet her forhindrer celle-overflade markører tab og opretholder immuncelle levedygtighed, så immunceller til at gennemgå yderligere celle rensning trin og kultur efter behov. Men, denne metode er ikke blevet testet for at udlede epiteliale celler fra denne fordøjelse.
In vivo modeller af kræft i bugspytkirtlen giver uvurderlige værktøjer til at forstå sygdomsprogression og vurdere nye Therapeutics mål3. Den ortotopiske model i særdeleshed er en omkostningseffektiv og reproducerbar model, der kan anvendes i store kohorter af mus samtidigt4,27. Den ortotopiske model giver også den cognate mikromiljø og intakt immunsystem for tumorvækst, hvilket gør det mere passende end den subkutane og PDX-modeller. Men vi har konstateret, at nogle elementer af immun infiltration kan variere mellem ortotopisk model og KPC mus, guld-standard murine model10. En af grundene til dette kunne være den accelererede tumorvækst set i ortotopisk model. Yderligere forskelle i tætheden af immuncelle undersæt er blevet beskrevet mellem ortotopiske og subkutane modeller3,28. Selv om den transgene KPC-model er dyrere og variabel6, bør de vigtigste resultater derfor verificeres i en lille kohorte af KPC-mus, hvor det er muligt.
Forberedelsen af tumorceller til ortotopisk kirurgi er et kritisk skridt i protokollen. Celler bør altid være i loggen fase af vækst og Mycoplasma-og infektion-fri. Ortotopisk kirurgi bør udskydes, hvis der er nogen bekymringer over tumorcellevækst. Brugen af kælder membran forbedrer tumor incidensrate over intravenøse celler uden det29 og reducerer celle lækage og dermed peritonealdialyse spredning27. Men, når suspenderet i kælderen membran, tumorceller bør hurtigt injiceres (inden for 2 timer) for at undgå enhver celle tab. Antallet af tumorceller, der kræves for at generere tumorer, vil sandsynligvis være celle afhængige, og en række cellenumre skal testes (f. eks. fra 100 – 100.000), som også kan bestemme tidspunktet for at nå endepunktet. Det er sandsynligt, at der vil være en fejlmargin, når du forbereder 1.000 celler per mus til injektion; Derfor, hvis flere dage af kirurgi er påkrævet, behandling af grupper bør spredes ligeligt på tværs af dage til at kontrollere for batch-effekter. De fleste kirurgiske trin kan ændres afhængigt af præferencer; dog skal man være forsigtig med ikke at forstyrre kælder membranen, når man udskifter bugspytkirtlen i bughulen eller lukker peritonealdialyse væggen. Kælder membran lækage kan forårsage tumorcellevækst på peritonealdialyse væggen, som danner hurtigt og kan resultere i at skulle ofre dyret tidligere.
Ideelt, bugspytkirtel tumorer bør hurtigt fordøjet efter høst og forberedt til ex vivo stimulation straks. Men, dette kan ikke være muligt, hvis der er et stort parti af tumorer at høste, i dette tilfælde tumorer bør holdes på is og fordøjet i partier. Typen, koncentrationen og længden af udsættelse for fordøjelsesenzymer har alle vist sig at påvirke et stort antal overflade molekyler på immunceller30,31,32. Fordøjelsestiden er også bevidst kort til at begrænse celledød33. Ford øjede celler kan fryses ned i fryse medium til langtidsopbevaring; Men, nogle celletab vil forekomme, når optøning. Fordøjelsesprocessen kan være mindre end optimal, hvis tumor stykker ikke er tilstrækkeligt tern før kollagenase inkubation og dette vil være indlysende som hårde tumor stykker vil forblive i filteret efter fordøjelsen. Kollagenase koncentrationen kan sænkes, hvis du arbejder med sund bugspytkirtel eller tidligt stadie tumorer; rapporter om udvinding sunde pancreas duktalt celler bruger betydeligt lavere koncentrationer34. En høj grad af epitelial celledød kan forventes under fordøjelsen; Men, immunceller bør tolerere processen godt. Alternative metoder findes for at isolere levedygtige epiteliale celler for organoid vækst35 eller for at bevare væv arkitektur36.
Modifikationer til stimulerings protokollen kan gøres let, afhængigt af den ønskede udlæsning og immuncelle analyseret (f. eks. makrofager eller B-celler). Brugen af panstimulations reagenser PMA/ionomycin diskriminerer ikke for TCR-antigen specificitet, hvilket gør det nyttigt, når antigenet ikke er kendt. Imidlertid er produktionen af IFNɣ tæt forbundet med TCR engagement37 og både IFNɣ og TNFα produktion er kritiske i pdac antitumoral svar38. Stimulering af PMA/ionomycin afspejler den maksimale kapacitet af T-celler til fremstilling af cytokiner, som måske eller måske ikke produceres af T-cellerne i Tumorens mikromiljø. Endogene produktion kan måles uden behov for stimulation; niveauerne kan dog være langt lavere eller ikke målbart. Der er alternative metoder til at stimulere T-celler: anti-CD3/28-belagte perler, som heller ikke kræver antigen eller andre immuncelle populationer. Fordelen ved denne metode er at gøre det muligt at kvantificere cytokinproduktion ved specifikke T-celle undersæt uden behov for separations metoder. Andre markører for cytotoksicitet (granzyme B og Perforin A), aktivitet (IL-2) eller immunsuppression (IL-10) kan også tilsættes21. Der findes imidlertid ikke flow cytometri af høj kvalitet til påvisning af alle cytokiner og interesse faktorer. Derfor, hvis der er andre applikationer såsom ELISA kræves stimulation kan udføres uden optagelse af brefeldin A/monensin, tillader cytokin frigivelse i supernatanten. Men, af note, dette vil tillade total Cell cytokin frigivelse og det vil ikke være muligt at bestemme, hvilke cellepopulationer bidrog.
Ifnγ produktion er et dominerende træk ved en antitumoralsk T-celle respons, der ofte anvendes som erstatning for TCR-antigen genkendelse37,38. Andre in vivo metoder, der mere præcist definerer antigen-specifikke reaktioner udnytte tumorceller udtrykker en kendt antigen, såsom ovalbumin eller SV40. Det universelle antigen kan derefter anvendes ex vivo til at teste T-celle genkendelse eller i kombination med en TCR-begrænset værts mus. Alternativt, hvor antigenet er ukendt, kan kvantificering af T-celle klonal ekspansion udføres ved bulk-TCR-sekvensering eller for nylig enkelt celle-TCR-sekvensering39,40. For fuldt ud at forstå tilstanden af intratumoral T-celle respons, bør markører, der indikerer udmattelse eller hæmmende receptorer, også måles, herunder: CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM3, 2B4. Samt markører for Effector T-celler (CD44Hi, CD62Lo) og proliferativ aktivitet, Ki67+ eller csfe fortynding41,42,43,44. Samlet set, den ortotopisk model giver en nyttig platform til hurtigt at teste terapeutiske strategier, især der kan modulere den antitumoral T-celle respons, der kan derefter valideres på en mindre kohorte af transgene, KPC, mus.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Animal Technician service og Dr. Alzbeta Talarovicova (Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, London, Storbritannien) for deres assistance under ortotopisk kirurgi. Vi vil også gerne takke Dr. Jennifer Morton (Beatson Institute for Cancer Research, Glasgow, Storbritannien) for hendes vejledning i kirurgisk teknik, Dr. Cristina Ghirelli (Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, London, Storbritannien) for hendes råd om tumor fordøjelse og Dr. Fabienne McClanahan (Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, London, Storbritannien) for hendes råd om ex vivo T celle stimulation protokoller. Vi vil også gerne takke det medicinske Forskningsråd (MRC), kræft i bugspytkirtlen forskning Fund (PCFR) og kræft i æggestokkene, der finansierede denne forskning.
6/0 gauge coated vicryl absorbable sutures | Ethicon | W9500T | |
70 μm pore-size cell strainer | Fisher Scientific | 11597522 | |
9 mm Clay Adams clips | VetTech Solutions | IN015A | |
anti-CD107a PE (clone 1D4B) | Biolegend | 121612 | 1:100 to culture media |
anti-CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Use at final dilution 1:200 |
anti-CD3 PerCP eFluor710 (clone 17A2) | Biolegend | 46-0032 | Use at final dilution 1:50 |
anti-CD4 FITC (clone GK1.5) | eBioscience | 11-0041 | Use at final dilution 1:100 |
anti-CD45 Brilliant Violet 605 (clone 30-F11) | Biolegend | 103140 | Use at final dilution 1:200 |
anti-CD8 Brilliant Violet 421 (clone 53-6.7) | Biolegend | 100738 | Use at final dilution 1:100 |
anti-IFN-gamma PE/Cy7 (clone XMG1.2) | Biolegend | 505826 | Use at final dilution 1:50 |
anti-TNF-alpha Alexa Fluor 647 (clone MP6-X) | Biolegend | 506314 | Use at final dilution 1:50 |
BD Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration | BD Biosciences | 354248 | Aliquot on ice and store in -20 °C |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
Cell Stimulation Cocktail (500x) (phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and ionomycin) | eBioscience | 00-4970-03 | 1x Final concentration PMA 0.081 μM, ionomycin 1.34 μM |
Clay Adams Autoclip Applier | VetTech Solutions | IN015B | |
Clay Adams Autoclip remover | VetTech Solutions | IN015B | |
Collagenase Type V from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9263 | 2 mg/mL in media |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100mL | |
DMEM High glucose (4.5 g/L) with L-Glutamine | PAA | E15-810 | |
DNase (Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Type II-S) stock 10 mg/mL in 0.15 M NaCl | Sigma-Aldrich | D4513 | Final concentration in digestion media 0.025 mg/mL |
Fixable Viability Dye 506 (FVD506) | eBioscience | 65-0866 | Use at 1:200 in PBS |
Foetal calf-serum (FCS) | GE Healthcare | A15-104 | 10% in RPMI |
Hamilton syringe 700 series, 25 μL volume, 22s gauge needle bevel tip | Fisher Scientific | 10100332 | |
Intracellular Fixation buffer and Intracellular Permeabilisation Buffer | eBioscience | 88-8824-00 | Dilute permeabilisation buffer to 1x in H2O |
Penicillin/streptomycin | PAA | 15140122 | 100 units/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin |
Protein transport inhibitor cocktail (500x) (brefeldin A and monesin) | eBioscience | 00-4980-03 | 1x Final concentration Brefeldin A 10.6 μM, monensin 2 μM |
RPMI-1640 (containing 0.3 g/L Glutamine) | Sigma-Aldrich | R8758 | |
Surgical Scalpel Blade No.10 | Swann-Morton | 0501 | |
Trypsin-EDTA Solution 10x | Sigma-Aldrich | 594-18C | Trypsin (0.1%) EDTA (0.4%) final concentration |
U-bottomed 96 microwell plate | VWR | 734-2080 | |
Universal Cotton Tipped Applicators – 6 inch x 100 | Medisave | UN982 | |
V-bottomed 96 microwell plate | VWR | 735-0184 |