Ce protocole décrit la génération chirurgicale des tumeurs pancréatiques orthopiques et la digestion rapide des tumeurs pancréatiques murines fraîchement isolées. Après la digestion, les populations viables de cellules immunitaires peuvent être employées pour l’analyse plus en aval, y compris la stimulation ex vivo des cellules de T pour la détection intracellulaire de cytokine par cytométrie d’écoulement.
Les modèles in vivo du cancer du pancréas fournissent des outils inestimables pour étudier la dynamique des maladies, l’infiltration immunitaire et de nouvelles stratégies thérapeutiques. Le modèle orthotopic de murine peut être exécuté sur de grandes cohortes de souris immunocompétentes simultanément, est relativement peu coûteux et préserve le microenvironnement de tissu cognate. La quantification de l’infiltration de cellule T et de l’activité cytotoxique dans les tumeurs orthotopiques fournit un indicateur utile d’une réponse antitumorale.
Ce protocole décrit la méthodologie pour la génération chirurgicale des tumeurs pancréatiques orthopiques par injection d’un petit nombre de cellules syngeneic de tumeur rechargées dans la membrane de sous-sol de 5 l directement dans le pancréas. Les souris portant des tumeurs orthotopiques prennent approximativement 30 jours pour atteindre le point final, à quel point les tumeurs peuvent être moissonisées et traitées pour la caractérisation de l’activité de cellule T tumeur-infiltrante. La digestion enzymatique rapide utilisant la collagène et le DNase permet d’extraire une suspension à cellule unique des tumeurs. La viabilité et les marqueurs de surface cellulaire des cellules immunitaires extraites de la tumeur sont préservés ; par conséquent, il est approprié pour les applications en aval multiples, y compris le tri des cellules immunitaires assistées par flux pour la culture ou l’extraction de l’ARN, l’analyse de cytométrie de flux des populations de cellules immunitaires. Ici, nous décrivons la stimulation ex vivo des populations de lymphocytes T pour la quantification intracellulaire de cytokine (IFNMD et TNFMD) et l’activité de dégranulation (CD107a) comme mesure de cytotoxicité globale. Des digests entiers-tumoral ont été stimulés avec l’acétate de myristate de phorbol et l’ionomycine pendant 5 h, en présence de l’anticorps anti-CD107a afin de surréglementer la production et la dégranulation de cytokine. L’addition de brefeldin A et de monensine pour les 4 h finaux a été effectuée pour bloquer le transport extracellulaire et maximiser la détection de cytokine. La coloration extra- et intra-cellulaire des cellules a ensuite été effectuée pour l’analyse de cytométrie du débit, où la proportion de cellules IFNMD, TNFet et CD107a, CD4 et CD8et T ont été quantifiées.
Cette méthode fournit une base de départ pour effectuer l’analyse complète du microenvironnement de tumeur.
Cette méthode détaille, du début à la fin, la procédure chirurgicale pour produire des tumeurs pancréatiques orthopiques utilisant une quantité minimale de matériel cellulaire et la dissociation rapide suivante des tumeurs établies pour l’analyse complète de cytométrie de flux des populations immunisées de cellules, y compris l’analyse ex vivo de la fonction de cellule T.
L’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) est un carcinome agressif avec seulement 8 % des patients survivant 5 ans1. Comme moins de 20 % des patients sont admissibles à la résection chirurgicale2,les échantillons de patients frais ne sont pas facilement accessibles pour la recherche et, par conséquent, les modèles in vivo fournissent des outils essentiels pour étudier cette maladie. Il existe plusieurs modèles murins de PDAC : orthotopic, sous-cutané, transgénique, intraveineux et patient-dérivé xénogreffe (PDX), largement décrit ici3. Le modèle orthotopic décrit ici permet l’injection de cellules PDAC syngéniques dans le pancréas des souris immunocompétentes. Cela peut être effectué dans de grandes cohortes de souris sauvages ou mutantes, et fournit ainsi un modèle rentable et cohérent pour la comparaison des agents thérapeutiques. Fait important, le modèle orthotopic fournit le microenvironnement cognat pour la croissance des cellules tumorales et métastases dans nos mains et d’autres4 à des sites cliniquement pertinents (par exemple, le foie), ce qui le rend plus cliniquement pertinent que les modèles sous-cutanés ou induits chimiquement. Les tumeurs orthotopiques affichent les caractéristiques clés de PDAC, telles qu’une forte réaction desmoplastique avec une abondance de fibroblastes et de dépôt de matrice extracellulaire5. Les modèles transgéniques de PDAC sont l’étalon-or du modèle de la murine et le plus couramment utilisé est le modèle KPC, qui exprime mutant KrasG12D / et Trp53R172H / sous le pancréas spécifique Pdx-1-Cre promoteur6. D’autres modèles KPC et autres PDAC in vivo sont examinés ici7. Les souris de KPC développent spontanément des tumeurs pancréatiques avec une progression de la maladie qui reproduit fidèlement des dispositifs de PDAChumain 6. Cependant, comme pour tous les modèles transgéniques, le programme de reproduction est coûteux, la progression tumorale est variable et nécessite donc souvent de grandes cohortes de souris. Les modèles PDX utilisent des cellules tumorales ou des morceaux dérivés du patient qui sont ensuite cultivés soit orthotopiquement ou plus souvent sous-cutanéechez chez des souris immunodéprimées. Les modèles de xénogreffe fournissent des outils utiles pour le dépistage des composés thérapeutiques et tiennent compte de l’hétérogénéité du patient. Cependant, ils ne fournissent pas un microenvironnement immunitaire complet, limitant ainsi leurs applications8,9.
Une fois établies, les tumeurs orthotopiques prennent typiquement environ 1 mois ou plus pour se développer (selon la ligne cellulaire utilisée) et forment de grandes tumeurs qui peuvent être facilement imaged par ultrason ou MRI pour suivre la progression et déterminer l’efficacité de traitement4,5,10. Cependant, une fois dans la croissance exponentielle, la dernière phase de la croissance de tumeur peut être rapide, ainsi la plupart des régimes de traitement sont commencés relativement tôt (par exemple, 14 jours)11,12. Le système immunitaire joue un rôle critique dans le développement de tumeur, y compris dans PDAC, qui est caractérisé par une tumeur immunosuppressive s’infiltrer avec le manque relatif des cellules De et la présence fréquente des cellules myéloïdes13. Une forte présence de lymphocytes T dans pDAC confère un meilleur pronostic14,15. Cependant, en tant qu’agents simples, les inhibiteurs de point de contrôle immunitaire qui soulagent l’immunosuppression de cellules T, tels que l’anti-CTLA-416 et anti-PD-L117,n’ont pas montré l’avantage clinique dans les patients de PDAC, probablement parce que la réactivité globale de cellule T est très basse. Cependant, les agents que les réponses principales de cellules T, telles que le vaccin anti-CD40, peuvent surmonter la résistance anti-PD-L1/CTLA-418,19 et la vaccination avec le vaccin allogeneic de PDAC de GM-CSF-sécrétant (GVAX) peut augmenter l’immunogénicité des tumeurs de PDAC20,indiquant que l’amélioration des réponses de cellules de T forme l’avenue thérapeutique importante.
Critique à une réponse antitumorale de cellule De est la reconnaissance des antigènes tumeur-dérivés par l’intermédiaire du récepteur de T-cell (TCR) et de la production suivante des cytokines et des granules cytotoxiques. Bien que la reconnaissance de l’antigène des lymphocytes T puisse être déterminée par le séquençage du TCR, cette approche est coûteuse et prend beaucoup de temps. Cependant, la quantification des sous-ensembles de cellules T infiltrants de tumeur fournit une bonne indication d’une réponse antitumoral. Un examen plus approfondi de l’activité des lymphocytes T ex vivo en termes de dégranulation, de production de cytokine et d’autres facteurs cytotoxiques fournit une analyse fonctionnelle plus approfondie. Ces essais peuvent être exécutés sur des échantillons frais de tumeur et beaucoup de paramètres de fonction de cellule T peuvent être mesurés rapidement par cytométrie de flux.
Les cellules CD8et CD4et T produisent des cytokines telles que les IFNMD et les TNMD pour potentialiser une réponse immunitaire21. IFN – induit la régulation MHCI sur les cellules cibles, induit la différenciation et le recrutement des cellules immunitaires et aide la mort cellulaire. La production d’IFNpar par les cellulesT CD8 est bien caractérisée pour faire partie d’une réponse antitumorale et est en corrélation avec la régression tumorale22,23. TNF est une autre cytokine proinflammatoire produite par les lymphocytes CD8et CD4T. Il améliore l’activation TCR-dépendante et la prolifération des lymphocytes T, aidant la réponse anti-tumorale. Lors de l’engagement TCR, cytotoxiques CD8– lymphocytes T peuvent subir la dégranulation, où les lysosomes sécréteurs préformés contenant des molécules cytotoxiques sont libérés dans la synapse immunologique pour causer la dégradation des cellules cibles21. Ces molécules comprennent la perforine, une protéine qui se lie à la membrane cellulaire cible, formant des pores qui perturbent ensuite l’intégrité de la membrane et permettent la diffusion21 ou l’endocytose24 d’autres molécules cytotoxiques, telles que Granzyme B, directement dans le cytoplasme de la cellule cible. Granzyme B est une protéase qui édicte la dégradation de protéines multiples dans la cellule cible, conduisant à la mort cellulaire21. La libération de ces molécules nécessite l’exocytose des endosomes à la surface cellulaire, où le marqueur endosomal CD107a (également connu sous le nom DE LAMP-1) est incorporé transitoirement dans la membrane cellulaire25.
La mesure de la sécrétion de cytokine par les lymphocytes T nécessite leur isolement par le tri des cellules assistées par le flux ou des tests de séparation à base de perles, qui ne peuvent pas être facilement effectués sur un grand nombre d’échantillons simultanément. Cependant, la mesure des cytokines intracellulaires ne nécessite aucune étape de pré-isolement et peut être facilement effectuée sur plusieurs échantillons à la fois, permettant une approche à haut débit. Comme les cytokines sont rapidement sécrétées par les lymphocytes T, les niveaux intracellulaires peuvent être indétectables et donc la cellule T nécessite une stimulation pour augmenter la production de cytokine basale. Pour évaluer la production de cytokine à l’antigène, l’antigène reconnu par le TCR doit être présenté à la cellule T par un APC apprêté in vitro. Dans les cas où la spécificité de l’antigène n’est pas connue, une approche de stimulation large est nécessaire. La stimulation de TCR peut être imitée utilisant des perles anti-CD3/28 qui fournissent l’activation et la costimulation de TCR, qui induit la production et la prolifération de cytokine. Cependant, une alternative plus rentable est l’utilisation de la PMA et de l’ionomycine, qui, ensemble, activent largement les voies de signalisation qui mènent à la synthèse et à la libération des cytokines intracellulaires. Plus précisément, la PMA active la protéine kinase C (PKC) et l’ionomycine soulève des ions intracellulaires Ca2, ce qui augmente la signalisation cellulaire. Afin de préserver le contenu intracellulaire des cytokines, cette stimulation peut être efficacement combinée avec des inhibiteurs du transport de protéines brefeldin A et monensine, qui bloquent les protéines dans le Golgi et empêchent ainsi la libération extracellulaire. L’utilisation de LA PMA/ionomycine est une méthode bien établie pour stimuler les lymphocytes T et il existe une forte corrélation entre les cytokines extracellulaires et intracellulaires26. La stimulation des lymphocytes T avec PMA et ionomycine augmente également le trafic de lysosome à la membrane cellulaire et ainsi CD107a devient transitoirement intégré sur la surface de la cellule avant d’être recyclé dans la cellule. En incluant un anticorps anti-CD107a pendant la stimulation, il est possible de l’utiliser comme marqueur de l’activité de dégranulation25.
Cette méthode digère rapidement les tumeurs pour fournir une suspension unicellulaire. À ce stade, les populations individuelles peuvent être directement tachées pour la cytométrie du débit ou purifiées par des méthodes en aval : tri cellulaire assisté par flux ou séparation des perles magnétiques. La préparation d’une suspension unicellulaire pour l’analyse de cytométrie de flux permet l’analyse à haut débit des populations de cellules immunitaires multiples et de leurs marqueurs phénotypiques, fournissant une quantification précise du nombre de cellules immunitaires et du phénotype.
Enfin, le protocole de digestion décrit ici empêche la perte de marqueurs de surface cellulaire et maintient la viabilité des cellules immunitaires, permettant aux cellules immunitaires de subir d’autres étapes de purification cellulaire et de la culture au besoin. Cependant, cette méthode n’a pas été testée pour dériver les cellules épithéliales de cette digestion.
Les modèles in vivo du cancer du pancréas fournissent des outils inestimables pour comprendre la progression de la maladie et évaluer de nouvelles cibles thérapeutiques3. Le modèle orthotopic en particulier est un modèle rentable et reproductible qui peut être appliqué dans de grandes cohortes de souris simultanément4,27. Le modèle orthotopic fournit également le microenvironnement cognat et le système immunitaire intact pour la croissance de tumeur, le rendant plus approprié que les sous-cutanés et Les modèles de PDX. Cependant, nous avons constaté que certains éléments de l’infiltration immunitaire peuvent différer entre le modèle orthotopic et les souris KPC, le modèle murine de référenceor 10. Une raison pour ceci pourrait être la croissance accélérée de tumeur vue dans le modèle orthotopic. D’autres différences dans la densité des sous-ensembles de cellules immunitaires ont été décrites entre les modèles orthotopiques et sous-cutanés3,28. Par conséquent, bien que le modèle transgénique de KPC soit plus coûteux et variable6,les résultats principaux devraient être vérifiés dans une petite cohorte de souris de KPC si possible.
La préparation des cellules tumorales pour la chirurgie orthotopique est une étape critique dans le protocole. Les cellules doivent toujours être dans la phase de journal de la croissance et mycoplasma- et sans infection. La chirurgie orthotopic devrait être reportée s’il y a n’importe des soucis au-dessus de la croissance de cellules de tumeur. L’utilisation de la membrane de sous-sol améliore le taux d’incidence de tumeur au-dessus des cellules d’injection sans elle29 et réduit la fuite de cellules et ainsi la propagation péritonéale27. Cependant, une fois suspendues dans la membrane de sous-sol, les cellules de tumeur devraient être rapidement injectées (dans un délai de 2 heures) pour éviter n’importe quelle perte de cellules. Le nombre de cellules tumorales nécessaires pour générer des tumeurs est susceptible d’être dépendant de la lignée cellulaire, et une gamme de numéros de cellules doivent être testés (par exemple, de 100 à 100 000) qui peuvent également déterminer le temps d’atteindre le point final. Il est probable qu’il y aura une marge d’erreur lors de la préparation de 1000 cellules par souris pour l’injection; par conséquent, si plusieurs jours de chirurgie sont nécessaires, le traitement des groupes devrait être réparti également sur plusieurs jours pour contrôler les effets des lots. La plupart des étapes chirurgicales peuvent être modifiées en fonction des préférences; cependant, il faut prendre soin de ne pas déranger la membrane du sous-sol lors du remplacement du pancréas dans la cavité abdominale ou de la fermeture de la paroi péritonéale. La fuite de membrane de sous-sol peut causer la croissance de cellules de tumeur sur la paroi péritonéale, qui se forment rapidement et peuvent avoir à devoir sacrifier l’animal plus tôt.
Idéalement, les tumeurs pancréatiques devraient être rapidement digérées après la récolte et préparées pour la stimulation ex vivo immédiatement. Cependant, ceci pourrait ne pas être possible s’il y a un grand lot de tumeurs à récolter, dans ce cas les tumeurs devraient être maintenues sur la glace et digérées dans des lots. Le type, la concentration et la durée de l’exposition aux enzymes digestives ont tous été montrés pour affecter un grand nombre de molécules de surface sur les cellules immunitaires30,31,32. Le temps de digestion est également délibérément court pour limiter la mort cellulaire33. Les cellules digérées peuvent être congelées dans un milieu de congélation pour un stockage à long terme; cependant, une certaine perte de cellules se produira lors de la décongélation. Le processus de digestion peut être moins qu’optimal si les morceaux de tumeur ne sont pas suffisamment coupés en dés avant l’incubation de collagène et ceci sera évident car les morceaux durs de tumeur resteront dans le filtre après digestion. La concentration de collagène peut être abaissée si vous travaillez avec le pancréas sain ou les tumeurs à un stade précoce; rapports sur l’extraction des cellules canalaires pancréatiques saines emploient des concentrations significativement plus basses34. Un degré élevé de mort épithéliale de cellules est à prévoir pendant la digestion ; cependant, les cellules immunitaires devraient tolérer le processus bien. D’autres méthodes existent pour isoler les cellules épithéliales viables pour la croissance organoïde35 ou pour préserver l’architecture tissulaire36.
Les modifications au protocole de stimulation peuvent être apportées facilement, selon la lecture souhaitée et la cellule immunitaire analysée (par exemple, les macrophages ou les cellules B). L’utilisation de réactifs pan-stimulation PMA / ionomycine ne discrimine pas pour la spécificité TCR-antigène, ce qui le rend utile lorsque l’antigène n’est pas connu. Cependant, la production d’IFN est étroitement associée à l’engagement de TCR37 et la production d’IFN et de TNFMD sont essentielles dans les réponses antitumorales pDAC38. La stimulation de PMA/ionomycine reflète la capacité maximale des lymphocytes T pour produire des cytokines, qui pourraient ou pourraient ne pas être produites par les cellules T dans le microenvironnement de tumeur. La production endogène peut être mesurée sans besoin de stimulation; cependant, les niveaux peuvent être beaucoup plus bas ou indétectables. Il existe d’autres méthodes pour stimuler les lymphocytes T : les perles enduites d’anti-CD3/28, qui ne nécessitent pas non plus d’antigène ou même d’autres populations de cellules immunitaires. L’avantage de cette méthode est de permettre la quantification de la production de cytokine par des sous-ensembles spécifiques de cellules T sans avoir besoin de méthodes de séparation. D’autres marqueurs de cytotoxicité (granzyme B et Perforin A), d’activité (IL-2) ou d’immunosuppression (IL-10) peuvent également être ajoutés21. Cependant, les anticorps de cytométrie de flux de haute qualité ne sont pas disponibles pour détecter toutes les cytokines et les facteurs d’intérêt. Par conséquent, s’il existe d’autres applications telles que ELISA nécessaire la stimulation peut être effectuée sans l’inclusion de la brefeldine A / monensine, permettant la libération de cytokine dans le supernatant. Cependant, il convient de noter que cela permettra la libération totale de cytokine cellulaire et il ne sera pas possible de déterminer quelles populations cellulaires ont contribué.
La production d’IFN est une caractéristique dominante d’une réponse antitumorale de cellule T, souvent employée comme substitut à la reconnaissance de TCR-antigène37,38. D’autres méthodes in vivo qui définissent plus précisément les réponses spécifiques à l’antigène utilisent des cellules tumorales exprimant un antigène connu, comme l’Ovalbumin ou le SV40. L’antigène universel peut ensuite être utilisé ex vivo pour tester la reconnaissance des lymphocytes T ou en combinaison avec une souris hôte tCR-restreinte. Alternativement, lorsque l’antigène est inconnu, la quantification de l’expansion clonale des lymphocytes T peut être effectuée par séquençage en vrac-TCR, ou plus récemment un séquençage de TCR à cellule unique39,40. Pour bien comprendre l’état de la réponse intratumorale des lymphocytes T, les marqueurs indicatifs d’épuisement ou de récepteurs inhibiteurs doivent également être mesurés, y compris : CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM3, 2B4. Ainsi que des marqueurs de lymphocytes T effecteurs (CD44salut, CD62lo) et l’activité proliférante, Ki67ou CSFE dilution41,42,43,44. Dans l’ensemble, le modèle orthotopic fournit une plate-forme utile pour tester rapidement des stratégies thérapeutiques, en particulier qui peuvent moduler la réponse antitumorale de T-cell, qui peut ensuite être validée sur une plus petite cohorte de transgéniques, KPC, souris.
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier le Animal Technician Service et le Dr Alzbeta Talarovicova (Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, Londres, Royaume-Uni) pour leur aide lors de la chirurgie orthotopique. Nous tenons également à remercier la Dre Jennifer Morton (Beatson Institute for Cancer Research, Glasgow, Royaume-Uni) pour ses conseils en technique chirurgicale, la Dre Cristina Ghirelli (Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, Londres, Royaume-Uni) pour ses conseils sur la digestion tumorale et la Dre Fabienne McClanahan (Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, Londres, Royaume-Uni) pour ses conseils concernant les protocoles de stimulation des cellules T ex vivo. Nous tenons également à remercier le Conseil de recherches médicales (CRM), le Fonds de recherche sur le cancer du pancréas (PCFR) et L’Action contre le cancer de l’ovaire qui a financé cette recherche.
6/0 gauge coated vicryl absorbable sutures | Ethicon | W9500T | |
70 μm pore-size cell strainer | Fisher Scientific | 11597522 | |
9 mm Clay Adams clips | VetTech Solutions | IN015A | |
anti-CD107a PE (clone 1D4B) | Biolegend | 121612 | 1:100 to culture media |
anti-CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Use at final dilution 1:200 |
anti-CD3 PerCP eFluor710 (clone 17A2) | Biolegend | 46-0032 | Use at final dilution 1:50 |
anti-CD4 FITC (clone GK1.5) | eBioscience | 11-0041 | Use at final dilution 1:100 |
anti-CD45 Brilliant Violet 605 (clone 30-F11) | Biolegend | 103140 | Use at final dilution 1:200 |
anti-CD8 Brilliant Violet 421 (clone 53-6.7) | Biolegend | 100738 | Use at final dilution 1:100 |
anti-IFN-gamma PE/Cy7 (clone XMG1.2) | Biolegend | 505826 | Use at final dilution 1:50 |
anti-TNF-alpha Alexa Fluor 647 (clone MP6-X) | Biolegend | 506314 | Use at final dilution 1:50 |
BD Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration | BD Biosciences | 354248 | Aliquot on ice and store in -20 °C |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
Cell Stimulation Cocktail (500x) (phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and ionomycin) | eBioscience | 00-4970-03 | 1x Final concentration PMA 0.081 μM, ionomycin 1.34 μM |
Clay Adams Autoclip Applier | VetTech Solutions | IN015B | |
Clay Adams Autoclip remover | VetTech Solutions | IN015B | |
Collagenase Type V from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9263 | 2 mg/mL in media |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100mL | |
DMEM High glucose (4.5 g/L) with L-Glutamine | PAA | E15-810 | |
DNase (Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Type II-S) stock 10 mg/mL in 0.15 M NaCl | Sigma-Aldrich | D4513 | Final concentration in digestion media 0.025 mg/mL |
Fixable Viability Dye 506 (FVD506) | eBioscience | 65-0866 | Use at 1:200 in PBS |
Foetal calf-serum (FCS) | GE Healthcare | A15-104 | 10% in RPMI |
Hamilton syringe 700 series, 25 μL volume, 22s gauge needle bevel tip | Fisher Scientific | 10100332 | |
Intracellular Fixation buffer and Intracellular Permeabilisation Buffer | eBioscience | 88-8824-00 | Dilute permeabilisation buffer to 1x in H2O |
Penicillin/streptomycin | PAA | 15140122 | 100 units/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin |
Protein transport inhibitor cocktail (500x) (brefeldin A and monesin) | eBioscience | 00-4980-03 | 1x Final concentration Brefeldin A 10.6 μM, monensin 2 μM |
RPMI-1640 (containing 0.3 g/L Glutamine) | Sigma-Aldrich | R8758 | |
Surgical Scalpel Blade No.10 | Swann-Morton | 0501 | |
Trypsin-EDTA Solution 10x | Sigma-Aldrich | 594-18C | Trypsin (0.1%) EDTA (0.4%) final concentration |
U-bottomed 96 microwell plate | VWR | 734-2080 | |
Universal Cotton Tipped Applicators – 6 inch x 100 | Medisave | UN982 | |
V-bottomed 96 microwell plate | VWR | 735-0184 |