यह प्रोटोकॉल ऑर्थोटोपिक अग्नाशय ट्यूमर की शल्य चिकित्सा पीढ़ी और हौसले से अलग मूत्र अग्नाशय ट्यूमर के तेजी से पाचन का वर्णन करता है। पाचन के बाद, व्यवहार्य प्रतिरक्षा कोशिका आबादी का उपयोग आगे डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए किया जा सकता है, जिसमें प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा इंट्रासेलर साइटोकिन का पता लगाने के लिए टी कोशिकाओं की पूर्व वीवो उत्तेजना शामिल है।
अग्नाशय के कैंसर के वीवो मॉडल में रोग गतिशीलता, प्रतिरक्षा घुसपैठ और नई चिकित्सीय रणनीतियों का अध्ययन करने के लिए अमूल्य उपकरण प्रदान करते हैं। ऑर्थोटोपिक म्यूरन मॉडल को इम्यूनोसक्षम चूहों के बड़े साथियों पर एक साथ किया जा सकता है, अपेक्षाकृत सस्ती है और कॉग्नेट ऊतक माइक्रोएनवायरमेंट को बरकरार रखता है। ऑर्थोटोपिक ट्यूमर के भीतर टी सेल घुसपैठ और साइटोटॉक्सिक गतिविधि का क्वांटिफिकेशन एंटीट्यूमरल प्रतिक्रिया का एक उपयोगी संकेतक प्रदान करता है।
यह प्रोटोकॉल सिंजेनिक ट्यूमर कोशिकाओं की एक कम संख्या के इंजेक्शन द्वारा ऑर्थोटॉपिक अग्नाशय ट्यूमर की शल्य चिकित्सा पीढ़ी के लिए पद्धति का वर्णन करता है 5 μL तहखाने झिल्ली में सीधे अग्न्याशय में निलंबित कर दिया । ऑर्थोटोपिक ट्यूमर वाले चूहों को एंडपॉइंट तक पहुंचने में लगभग 30 दिन लगते हैं, जिस पर ट्यूमर को काटा जा सकता है और ट्यूमर-घुसपैठ टी सेल गतिविधि के लक्षण वर्णन के लिए संसाधित किया जा सकता है। कोलेजेनेज और DNase का उपयोग कर तेजी से एंजाइमैटिक पाचन ट्यूमर से निकाले जाने के लिए एक एकल सेल निलंबन की अनुमति देता है। ट्यूमर से निकाली गई प्रतिरक्षा कोशिकाओं की व्यवहार्यता और कोशिका सतह मार्कर संरक्षित हैं; इसलिए, यह कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है, जिसमें संस्कृति या आरएनए निष्कर्षण के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं की प्रवाह-सहायता प्राप्त सेल छंटाई, प्रतिरक्षा कोशिका आबादी के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण शामिल हैं। यहां, हम इंट्रासेलर साइटोकिन क्वांटिफिकेशन (IFNο और TNFα) और डिग्रेनुअलेशन गतिविधि (CD107a) के लिए टी सेल आबादी के पूर्व विवो उत्तेजना का वर्णन समग्र साइटोटॉक्सिकिसिटी के उपाय के रूप में करते हैं। साइटोकिन उत्पादन और डिग्रेनुलेशन को अपरेज़ करने के लिए एंटी-सीडी107a एंटीबॉडी की उपस्थिति में पूरे ट्यूमर डाइजेस्ट को 5 एच के लिए phorbol myristate एसीटेट और आयनमाइसिन के साथ प्रेरित किया गया था। अंतिम 4 घंटे के लिए ब्रेफेल्डिन ए और मोनेसिन के अलावा एक्स्ट्रासेलुलर परिवहन को ब्लॉक करने और साइटोकाइन डिटेक्शन को अधिकतम करने के लिए किया गया था। कोशिकाओं के अतिरिक्त और अंतर-सेलुलर धुंधला तो प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए प्रदर्शन किया गया था, जहां IFNο+, TNFα+ और CD107a+ CD4+ और CD8+ टी कोशिकाओं के अनुपात की मात्रा निर्धारित की गई थी ।
यह विधि ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट का व्यापक विश्लेषण करने के लिए एक प्रारंभिक आधार प्रदान करती है।
इस विधि विवरण, स्टार्ट-टू-फिनिश से, सेलुलर सामग्री की न्यूनतम मात्रा का उपयोग करके ऑर्थोटोपिक अग्नाशय ट्यूमर पैदा करने के लिए शल्य प्रक्रिया और टी सेल फ़ंक्शन के पूर्व वीवो विश्लेषण सहित प्रतिरक्षा कोशिका आबादी के व्यापक प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए स्थापित ट्यूमर का बाद में तेजी से विच्छेदन।
अग्नाशय के डक्टल एडेनोकार्सिनोमा (पीडीएसी) एक आक्रामक कार्सिनोमा है जिसमें केवल 8% रोगियों को 5 साल1जीवित हैं। चूंकि 20% से कम रोगी सर्जिकल रिसेक्शन2के लिए पात्र हैं, इसलिए ताजा रोगी के नमूने अनुसंधान के लिए आसानी से सुलभ नहीं हैं और इस प्रकार वीवो मॉडल इस बीमारी की जांच के लिए आवश्यक उपकरण प्रदान करते हैं। पीडीएसी के कई मूत्र मॉडल हैं: ऑर्थोटोपिक, चमड़े के नीचे, ट्रांसजेनिक, नसों में और रोगी-व्युत्पन्न विद्वेष (पीडीएक्स), बड़े पैमाने पर यहां3वर्णित हैं। यहां वर्णित ऑर्थोटोपिक मॉडल इम्यूनोसक्षम चूहों के अग्न्याशय में सिंजेनिक पीडीएसी कोशिकाओं के इंजेक्शन की अनुमति देता है। यह जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती चूहों के बड़े साथियों में किया जा सकता है, और इस प्रकार चिकित्सीय एजेंटों की तुलना के लिए एक लागत प्रभावी और सुसंगत मॉडल प्रदान करता है। महत्वपूर्ण बात, ऑर्थोटोपिक मॉडल ट्यूमर सेल विकास और हमारे हाथों में मेटास्टेसाइज के लिए कॉग्नेट माइक्रोएनवायरमेंट प्रदान करता है और अन्य4 चिकित्सकीय प्रासंगिक साइटों (जैसे, यकृत) के लिए, यह चमड़े के नीचे या रासायनिक रूप से प्रेरित मॉडलों की तुलना में अधिक चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक बनाता है। ऑर्थोटोपिक ट्यूमर पीडीएसी की प्रमुख विशेषताओं को प्रदर्शित करते हैं, जैसे कि फाइब्रोब्लास्ट और एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स जमाव5की बहुतायत के साथ एक मजबूत डेस्मोप्लास्टिक प्रतिक्रिया। पीडीएसी के ट्रांसजेनिक मॉडल मूत्र मॉडल के सोने के मानक हैं और सबसे अधिक उपयोग किया जाने वाला केपीसी मॉडल है, जो अग्न्याशय-विशिष्ट Pdx-1-क्रे प्रमोटर6के तहत उत्परिवर्ती KrasG12D/+ और Trp53R172H/+ को व्यक्त करता है । अतिरिक्त केपीसी और वीवो पीडीएसी मॉडल में अन्य की समीक्षा यहां7. केपीसी चूहों अनायास एक रोग प्रगति है कि ईमानदारी से मानव PDAC6की सुविधाओं को दोहराने के साथ अग्नाशय ट्यूमर विकसित । हालांकि, सभी ट्रांसजेनिक मॉडल के लिए, प्रजनन कार्यक्रम महंगा है, ट्यूमर प्रगति चर है और इसलिए अक्सर चूहों के बड़े साथियों की आवश्यकता होती है। पीडीएक्स मॉडल रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर कोशिकाओं या टुकड़ों का उपयोग करते हैं जो तब या तो ऑर्थोटोपिक रूप से या अधिक बार इम्यूनोसमझौता चूहों में चमड़े के नीचे उगाए जाते हैं। Xenograft मॉडल चिकित्सकीय यौगिकों की स्क्रीनिंग और रोगी विषमता के लिए खाते के लिए उपयोगी उपकरण प्रदान करते हैं। हालांकि, वे एक पूर्ण प्रतिरक्षा माइक्रोएनवायरमेंट प्रदान नहीं करते हैं, इस प्रकार उनके अनुप्रयोगों8,9को सीमित करते हैं।
एक बार स्थापित होने के बाद, ऑर्थोटोपिक ट्यूमर को बढ़ने में आम तौर पर लगभग 1 महीने या उससे अधिक समय लगता है (उपयोग की जाने वाली सेल लाइन के आधार पर) और बड़े ट्यूमर बनाते हैं जिन्हें प्रगति को ट्रैक करने और उपचार प्रभावकारिता4,5,10निर्धारित करने के लिए अल्ट्रासाउंड या एमआरआई द्वारा आसानी से चित्रित किया जा सकता है। हालांकि, एक बार घातीय विकास में, ट्यूमर के विकास का अंतिम चरण तेजी से हो सकता है, इसलिए अधिकांश उपचार आहार अपेक्षाकृत जल्दी शुरू किए जाते हैं (जैसे, 14 दिन)11,12। प्रतिरक्षा प्रणाली ट्यूमर के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, जिसमें पीडीएसी शामिल है, जो टी कोशिकाओं की सापेक्ष कमी और माइलॉयड कोशिकाओं13की लगातार उपस्थिति के साथ घुसपैठ करने वाले इम्यूनोसप्रेसिव ट्यूमर की विशेषता है। पीडीएसी में टी कोशिकाओं की उच्च उपस्थिति एक बेहतर पूर्वानुमान14,15प्रदान करती है । हालांकि, एकल एजेंटों के रूप में, प्रतिरक्षा चेकपॉइंट अवरोधक जो टी सेल इम्यूनोदमन को राहत देते हैं, जैसे एंटी-सीटीएलए-416 और एंटी-पीडी-एल 117,ने पीडीएसी रोगियों में नैदानिक लाभ नहीं दिखाया है, सबसे अधिक संभावना है क्योंकि समग्र टी सेल प्रतिक्रियाशीलता बहुत कम है। हालांकि, एजेंटों कि इस तरह के विरोधी CD40 के रूप में प्रधानमंत्री टी सेल प्रतिक्रियाओं, विरोधी पीडी-L1/CTLA-4 प्रतिरोध18,19 और जीएम-सीएसएफ के साथ टीकाकरण-एलोजेनिक PDAC वैक्सीन (GVAX) पीडीएसी ट्यूमर20की इम्यूनोजेनिकिटी में वृद्धि कर सकते हैं, यह दर्शाता है कि टी सेल प्रतिक्रियाओं को बढ़ाने महत्वपूर्ण चिकित्सीय एवेंयू रूपों ।
एंटीट्यूमरल टी सेल प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण टी-सेल रिसेप्टर (टीसीआर) के माध्यम से ट्यूमर-व्युत्पन्न एंटीजन की मान्यता और साइटोटॉक्सिक साइटोकिन्स और कणिकाओं के बाद के उत्पादन है। जबकि टी सेल एंटीजन-मान्यता टीसीआर अनुक्रमण द्वारा निर्धारित की जा सकती है, यह दृष्टिकोण महंगा और समय लेने वाला है। हालांकि, ट्यूमर घुसपैठ टी सेल सबसेट का परिमाणीकरण एक विरोधी ट्यूमर प्रतिक्रिया का एक अच्छा संकेत प्रदान करता है । डिग्रेनुशन, साइटोकाइन उत्पादन और अन्य साइटोटॉक्सिक कारकों के संदर्भ में टी सेल गतिविधि पूर्व वीवो की आगे की परीक्षा एक गहरी कार्यात्मक विश्लेषण प्रदान करती है। ये परख ताजा ट्यूमर के नमूनों पर किया जा सकता है और टी सेल समारोह के कई मापदंडों प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा तेजी से मापा जा सकता है।
सीडी8+ और सीडी 4+ टी कोशिकाएं एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया21को शक्तिशाली बनाने के लिए इस तरह के IFNο और TNFα का उत्पादन करती हैं । आईएफएन लक्ष्य कोशिकाओं पर एमएचसीआई अपरेगुलेशन को प्रेरित करता है, प्रतिरक्षा कोशिकाओं और एड्स सेल मौत के भेदभाव और भर्ती को प्रेरित करता है। सीडी 8+ टी कोशिकाओं द्वारा IFNο उत्पादन अच्छी तरह से एक एंटीट्यूमरल प्रतिक्रिया का हिस्सा है और ट्यूमर प्रतिगमन22,23के साथ सहसंबंधित है । TNFα सीडी 8+ और सीडी 4+ टी कोशिकाओं दोनों द्वारा उत्पादित एक और भड़काऊ साइटोकिन है। यह टीसीआर-निर्भर सक्रियण और टी कोशिकाओं के प्रसार को बढ़ाता है, जो ट्यूमर विरोधी प्रतिक्रिया को सहायता करता है। टीसीआर सगाई पर, साइटोटॉक्सिक सीडी 8+ टी कोशिकाएं डिग्रेनुशेशन से गुजर सकती हैं, जहां साइटोटॉक्सिक अणुओं वाले पूर्व-गठित गुप्त लिसोसोम्स को लक्ष्य-कोशिका क्षरण21का कारण बनने के लिए इम्यूनोलॉजिकल सिनैप्स में जारी किया जाता है। इन अणुओं में पेरफोइन शामिल है, एक प्रोटीन जो लक्ष्य कोशिका झिल्ली को बांधता है, छिद्रों का निर्माण करता है जो तब झिल्ली अखंडता को बाधित करता है और अन्य साइटोटॉक्सिक अणुओं में से24 कोप्रसार की अनुमति देता है, जैसे कि ग्रैनज़िम बी, सीधे लक्ष्य कोशिका के साइटोप्लाज्म में। ग्रैनज़ीम बी एक प्रोटीज़ है जो लक्ष्य कोशिका के भीतर कई प्रोटीन के क्षरण को अधिनियमित करता है, जिससे सेल डेथ21हो जाती है। ऐसे अणुओं की रिहाई के लिए कोशिका की सतह पर एंडोसोम के बहिर्वेस की आवश्यकता होती है, जहां एंडोसोमल मार्कर सीडी107a (जिसे लैंप-1 के रूप में भी जाना जाता है) को कोशिका झिल्ली25में क्षणिक रूप से शामिल किया जाता है।
टी कोशिकाओं द्वारा साइटोकिन स्राव की माप या तो प्रवाह की सहायता से सेल छंटाई या मनका आधारित जुदाई परख, जो आसानी से नमूनों की बड़ी संख्या पर एक साथ प्रदर्शन नहीं किया जा सकता द्वारा उनके अलगाव की आवश्यकता है । हालांकि, इंट्रासेलर साइटोकिन्स की माप के लिए किसी भी पूर्व-अलगाव चरणों की आवश्यकता नहीं होती है और एक समय में कई नमूनों पर आसानी से किया जा सकता है, जिससे उच्च-थ्रूपुट दृष्टिकोण की अनुमति मिलती है। चूंकि साइटोकिन्स टी कोशिकाओं द्वारा तेजी से स्रावित होते हैं, इंट्रासेलर स्तर अज्ञेय हो सकते हैं और इस प्रकार टी सेल को बेसल साइटोकिन उत्पादन बढ़ाने के लिए उत्तेजना की आवश्यकता होती है। एंटीजन संचालित साइटोकिन उत्पादन का आकलन करने के लिए, टीसीआर द्वारा मान्यता प्राप्त एंटीजन को विट्रो में एक प्राइमेड एपीसी द्वारा टी सेल में प्रस्तुत किया जाना चाहिए। ऐसे मामलों में जहां एंटीजन विशिष्टता ज्ञात नहीं है, एक व्यापक उत्तेजना दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है। टीसीआर उत्तेजना विरोधी सीडी 3/28 मोतियों का उपयोग करके नकल की जा सकती है जो टीसीआर सक्रियण और कॉस्टिमुलेशन दोनों प्रदान करते हैं, जो साइटोकिन उत्पादन और प्रसार को प्रेरित करता है । हालांकि, एक अधिक लागत प्रभावी विकल्प पीएमए और आयनोमाइसिन का उपयोग है, जो एक साथ मोटे तौर पर सिग्नलिंग रास्तों को सक्रिय करता है जो संश्लेषण और इंट्रासेलर साइटोकिन्स की रिहाई का कारण बनते हैं। विशेष रूप से, पीएमए प्रोटीन किनेज सी (पीकेसी) को सक्रिय करता है और आयनमाइसिन इंट्रासेलर सीए2 + आयनों को उठाता है, जिससे सेल सिग्नलिंग में वृद्धि होती है। साइटोकिन्स की इंट्रासेलर सामग्री को संरक्षित करने के लिए, इस उत्तेजना को प्रभावी ढंग से प्रोटीन-परिवहन अवरोधक ब्रेफेल्डिन ए और मोनेसिन के साथ जोड़ा जा सकता है, जो गोलगी में प्रोटीन को अवरुद्ध करते हैं और इस प्रकार एक्स्ट्रासेलुलर रिलीज को रोकते हैं। पीएमए/आयनमाइसिन का उपयोग टी कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए एक सुस्थापित विधि है और एक्सट्रासेलुलर-रिलीज और इंट्रासेलर साइटोकिंस26के बीच एक मजबूत संबंध है । पीएमए और आयनमाइसिन के साथ टी कोशिकाओं की उत्तेजना भी कोशिका झिल्ली के लिए lysosome तस्करी बढ़ जाती है और इस तरह CD107a सेल में पुनर्नवीनीकरण होने से पहले सेल की सतह पर क्षणिक रूप से एकीकृत हो जाता है । उत्तेजना के दौरान एक एंटी-सीडी107a एंटीबॉडी को शामिल करके, इसे डिग्रेनुलेशन गतिविधि25के मार्कर के रूप में उपयोग करना संभव है।
यह विधि ट्यूमर को एक एकल-कोशिका निलंबन प्रदान करने के लिए तेजी से पचाती है। इस बिंदु पर, व्यक्तिगत आबादी सीधे प्रवाह साइटोमेट्री के लिए दाग या डाउनस्ट्रीम तरीकों से शुद्ध किया जा सकता है: प्रवाह की सहायता से सेल छंटाई या चुंबकीय मनका जुदाई । प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए एकल-सेल निलंबन की तैयारी कई प्रतिरक्षा कोशिका आबादी और उनके फेनोटाइपिक मार्कर के उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण की अनुमति देती है, जो प्रतिरक्षा सेल संख्या और फेनोटाइप का सटीक मात्रा प्रदान करती है।
अंत में, यहां वर्णित पाचन प्रोटोकॉल सेल-सतह मार्कर हानि को रोकता है और प्रतिरक्षा कोशिका व्यवहार्यता को बनाए रखता है, जिससे प्रतिरक्षा कोशिकाओं को आवश्यकतानुसार आगे कोशिका शुद्धि चरणों और संस्कृति से गुजरना पड़ता है। हालांकि, इस विधि को इस पाचन से एपिथेलियल कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए परीक्षण नहीं किया गया है।
अग्नाशय के कैंसर के वीवो मॉडल रोग प्रगति को समझने और नए चिकित्सीय लक्ष्य3का आकलन करने के लिए अमूल्य उपकरण प्रदान करते हैं । विशेष रूप से ऑर्थोटोपिक मॉडल एक लागत प्रभावी और प्रजनन योग्य मॉडल है जिसे चूहों के बड़े साथियों में एक साथ4,27को लागू किया जा सकता है। ऑर्थोटोपिक मॉडल ट्यूमर के विकास के लिए कॉग्नेट माइक्रोएनवायरमेंट और बरकरार प्रतिरक्षा प्रणाली भी प्रदान करता है, जिससे यह चमड़े के नीचे और पीडीएक्स-मॉडल की तुलना में अधिक उपयुक्त हो जाता है। हालांकि, हमने पाया है कि प्रतिरक्षा घुसपैठ के कुछ तत्व ऑर्थोटोपिक मॉडल और केपीसी चूहों, सोने के मानक मूत्र मॉडल10के बीच भिन्न हो सकते हैं। इसका एक कारण ऑर्थोटोपिक मॉडल में देखी गई त्वरित ट्यूमर वृद्धि हो सकती है। प्रतिरक्षा कोशिका के सबसेटों के घनत्व में और अंतर ऑर्थोटोपिक और चमड़े के नीचे मॉडल3,28के बीच वर्णित किया गया है । इसलिए, हालांकि ट्रांसजेनिक केपीसी मॉडल अधिक महंगा और चर6है, प्रमुख निष्कर्षों को जहां संभव हो केपीसी चूहों की एक छोटी सी पलटन में सत्यापित किया जाना चाहिए।
ऑर्थोटोपिक सर्जरी के लिए ट्यूमर कोशिकाओं की तैयारी प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है। कोशिकाओं को हमेशा विकास और माइकोप्लाज्मा के लॉग चरण में होना चाहिए- और संक्रमण मुक्त। यदि ट्यूमर सेल के विकास पर कोई चिंता है तो ऑर्थोटोपिक सर्जरी स्थगित की जानी चाहिए। बेसमेंट झिल्ली के उपयोग से ट्यूमर की घटना दर में सुधार होता है , जो29 बिना कोशिकाओं को इंजेक्ट करता है और कोशिका रिसाव को कम करता है और इस प्रकार पेरिटोनियलफैलता है 27। हालांकि, एक बार तहखाने झिल्ली में निलंबित, ट्यूमर कोशिकाओं को किसी भी कोशिका हानि से बचने के लिए तेजी से (2 घंटे के भीतर) इंजेक्शन दिया जाना चाहिए। ट्यूमर उत्पन्न करने के लिए आवश्यक ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या सेल-लाइन निर्भर होने की संभावना है, और सेल संख्या की एक श्रृंखला का परीक्षण किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, 100 – 100,000 से) जो एंडपॉइंट तक पहुंचने का समय भी निर्धारित कर सकता है। यह संभावना है कि इंजेक्शन के लिए प्रति माउस 1,000 कोशिकाओं को तैयार करते समय त्रुटि का मार्जिन होगा; इसलिए, यदि सर्जरी के कई दिनों की आवश्यकता होती है, तो बैच प्रभावों के लिए नियंत्रित करने के लिए समूहों के उपचार को दिनों में समान रूप से फैलाया जाना चाहिए। अधिकांश सर्जिकल चरणों को वरीयताओं के आधार पर संशोधित किया जा सकता है; हालांकि, पेट की गुहा में अग्न्याशय की जगह या पेरिटोनियल दीवार को बंद करते समय तहखाने झिल्ली को परेशान करने के लिए देखभाल नहीं की जानी चाहिए। तहखाने झिल्ली रिसाव पेरिटोनियल दीवार पर ट्यूमर सेल विकास का कारण बन सकता है, जो तेजी से बनता है और इसके परिणामस्वरूप पहले जानवर का बलिदान हो सकता है।
आदर्श रूप से, अग्नाशय के ट्यूमर को फसल के बाद तेजी से पचाया जाना चाहिए और तुरंत पूर्व वीवो उत्तेजना के लिए तैयार किया जाना चाहिए। हालांकि, यह संभव नहीं हो सकता है अगर वहां ट्यूमर का एक बड़ा बैच फसल के लिए है, इस मामले में ट्यूमर बर्फ पर रखा जाना चाहिए और बैचों में पचा । पाचन एंजाइमों के संपर्क में आने वाले प्रकार, एकाग्रता और लंबाई को प्रतिरक्षा कोशिकाओं30,31,32पर सतह के अणुओं की एक बड़ी संख्या को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है । पाचन समय भी जानबूझकर सेल मौत33को सीमित करने के लिए कम है . पचाकोशिकाओं को दीर्घकालिक भंडारण के लिए ठंड माध्यम में नीचे जमे हुए किया जा सकता है; हालांकि, कुछ सेल हानि तब होगी जब विगलन। पाचन प्रक्रिया इष्टतम से कम हो सकती है यदि ट्यूमर के टुकड़े कोलेजेनेस ऊष्मायन से पहले पर्याप्त रूप से नहीं हैं और यह स्पष्ट हो जाएगा क्योंकि पाचन के बाद फिल्टर में हार्ड ट्यूमर टुकड़े रहेंगे। यदि स्वस्थ अग्न्याशय या प्रारंभिक चरण के ट्यूमर के साथ काम कर रहे हैं तो कोलेजेनेस एकाग्रता को कम किया जा सकता है; स्वस्थ अग्नाशय डक्टल कोशिकाओं को निकालने पर रिपोर्ट काफी कम सांद्रता34का उपयोग करें . पाचन के दौरान उच्च स्तर की एपिथेलियल सेल मृत्यु की उम्मीद की जानी है; हालांकि, प्रतिरक्षा कोशिकाओं को प्रक्रिया को अच्छी तरह से सहन करना चाहिए। ऑर्गनॉइड विकास35 के लिए व्यवहार्य एपिथेलियल कोशिकाओं को अलग करने या ऊतक वास्तुकला36को संरक्षित करने के लिए वैकल्पिक तरीके मौजूद हैं।
उत्तेजना प्रोटोकॉल में संशोधन आसानी से किए जा सकते हैं, वांछित रीड-आउट और प्रतिरक्षा कोशिका के आधार पर विश्लेषण किया गया (जैसे, मैक्रोफेज या बी कोशिकाएं)। पैन-उत्तेजना अभिकर्मकों का उपयोग पीएमए/आयनोमाइसिन टीसीआर-एंटीजन विशिष्टता के लिए भेदभाव नहीं करता है, जिससे एंटीजन की जानकारी नहीं होने पर यह उपयोगी हो जाता है । हालांकि, आईएफएन का उत्पादन टीसीआर सगाई37 से निकटता से जुड़ा हुआ है और आईएफएन और टीएनफ्लेम दोनों उत्पादन पीडीएसी एंटीट्यूमरल प्रतिक्रियाओं38में महत्वपूर्ण हैं। पीएमए/आयनमाइसिन उत्तेजना साइटोकिन्स का उत्पादन करने के लिए टी कोशिकाओं की अधिकतम क्षमता को दर्शाती है, जो ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट के भीतर टी कोशिकाओं द्वारा उत्पादित हो सकती है या नहीं हो सकती है । उत्तेजना की आवश्यकता के बिना एंडोजेनस उत्पादन को मापा जा सकता है; हालांकि, स्तर अभी तक कम या अज्ञेय हो सकते हैं। टी कोशिकाओं को प्रोत्साहित करने के लिए वैकल्पिक तरीके हैं: एंटी-सीडी 3/28-लेपित मोतियों, जो एंटीजन या वास्तव में अन्य प्रतिरक्षा सेल आबादी की आवश्यकता नहीं है। इस विधि का लाभ पृथक्करण विधियों की आवश्यकता के बिना विशिष्ट टी सेल सबसेट द्वारा साइटोकिन उत्पादन की मात्रा निर्धारित करने की अनुमति दे रहा है। साइटोटॉक्सिकिटी (ग्रैनज़ीम बी और पेर्फोरिन ए), गतिविधि (आईएल-2) या इम्यूनोसप्रेसन (आईएल-10) के अन्य मार्कर भी21जोड़े जा सकते हैं। हालांकि, उच्च गुणवत्ता वाले प्रवाह साइटोमेट्री एंटीबॉडी सभी साइटोकिन्स और ब्याज के कारकों का पता लगाने के लिए उपलब्ध नहीं हैं। इसलिए, यदि एलिसा जैसे अन्य अनुप्रयोगों की आवश्यकता है तो उत्तेजना को ब्रेफेलिन ए/मोनोसिन को शामिल किए बिना किया जा सकता है, जिससे साइटोकिन को अधिनेचिता में छोड़ने की अनुमति मिलती है । हालांकि, ध्यान दें, यह कुल सेल साइटोकाइन रिलीज की अनुमति देगा और यह निर्धारित करना संभव नहीं होगा कि किस सेल आबादी ने योगदान दिया।
IFNο उत्पादन एक एंटीट्यूमरल टी सेल प्रतिक्रिया की एक प्रमुख विशेषता है, जिसे अक्सर टीसीआर-एंटीजन मान्यता37,38के विकल्प के रूप में उपयोग किया जाता है। वीवो विधियों में अन्य जो एंटीजन-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं को अधिक सटीक रूप से परिभाषित करते हैं, ट्यूमर कोशिकाओं का उपयोग करते हैं जो ओवएलबमिन या एसवी40 जैसे ज्ञात एंटीजन को व्यक्त करते हैं। यूनिवर्सल एंटीजन तो पूर्व वीवो टी सेल मांयता का परीक्षण करने के लिए या एक टीसीआर प्रतिबंधित मेजबान माउस के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, जहां एंटीजन अज्ञात है, टी सेल क्लोनल विस्तार का परिमाणीकरण थोक-टीसीआर अनुक्रमण, या हाल ही में एकल-सेल टीसीआर अनुक्रमण39,40द्वारा किया जा सकता है। पूरी तरह से अंतरंग नैतिक टी सेल प्रतिक्रिया की स्थिति को समझने के लिए, थकावट या निषेधात्मक रिसेप्टर्स के संकेत मार्कर भी शामिल मापा जाना चाहिए: CTLA-4, पीडी-1, LAG-3, TIM3, 2B4 । साथ ही प्रभावक टी कोशिकाओं (सीडी 44हाय,सीडी62लो)और प्रसार गतिविधि, Ki67+ या CSFE कमजोर पड़ने41,42,43,44के मार्कर। कुल मिलाकर, ऑर्थोटोपिक मॉडल चिकित्सकीय रणनीतियों का तेजी से परीक्षण करने के लिए एक उपयोगी मंच प्रदान करता है, विशेष रूप से जो एंटीट्यूमरल टी-सेल प्रतिक्रिया को मिलासकता है, जिसे ट्रांसजेनिक, केपीसी, चूहों के छोटे पलटन पर मान्य किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
हम आर्थोटोपिक सर्जरी के दौरान उनकी सहायता के लिए एनिमल टेक्नीशियन सर्विस और डॉ अल्जबबीटा तालारोविचोवा (बार्ट्स कैंसर इंस्टीट्यूट, क्वीन मैरी यूनिवर्सिटी ऑफ लंदन, लंदन, यूनाइटेड किंगडम) का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । हम सर्जिकल तकनीक में उनके मार्गदर्शन के लिए डॉ जेनिफर मॉर्टन (बीटसन इंस्टीट्यूट फॉर कैंसर रिसर्च, ग्लासगो, यूनाइटेड किंगडम) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, डॉ क्रिस्टीना घीरेली (बार्ट्स कैंसर इंस्टीट्यूट, क्वीन मैरी यूनिवर्सिटी ऑफ लंदन, लंदन, यूनाइटेड किंगडम) ट्यूमर पाचन और डॉ फैबियन मैकक्लानहान (बार्ट्स कैंसर इंस्टीट्यूट, क्वीन मैरी यूनिवर्सिटी ऑफ लंदन, लंदन, यूनाइटेड किंगडम) को एक्स विवो ट्नो टी, यूनाइटेड किंगडम के बारे में उनकी सलाह के लिए हम इस शोध को वित्तपोषित करने वाले मेडिकल रिसर्च काउंसिल (एमआरसी), अग्नाशय कैंसर अनुसंधान कोष (पीसीएफआर) और ओवेरियन कैंसर एक्शन का भी शुक्रिया अदा करना चाहेंगे ।
6/0 gauge coated vicryl absorbable sutures | Ethicon | W9500T | |
70 μm pore-size cell strainer | Fisher Scientific | 11597522 | |
9 mm Clay Adams clips | VetTech Solutions | IN015A | |
anti-CD107a PE (clone 1D4B) | Biolegend | 121612 | 1:100 to culture media |
anti-CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Use at final dilution 1:200 |
anti-CD3 PerCP eFluor710 (clone 17A2) | Biolegend | 46-0032 | Use at final dilution 1:50 |
anti-CD4 FITC (clone GK1.5) | eBioscience | 11-0041 | Use at final dilution 1:100 |
anti-CD45 Brilliant Violet 605 (clone 30-F11) | Biolegend | 103140 | Use at final dilution 1:200 |
anti-CD8 Brilliant Violet 421 (clone 53-6.7) | Biolegend | 100738 | Use at final dilution 1:100 |
anti-IFN-gamma PE/Cy7 (clone XMG1.2) | Biolegend | 505826 | Use at final dilution 1:50 |
anti-TNF-alpha Alexa Fluor 647 (clone MP6-X) | Biolegend | 506314 | Use at final dilution 1:50 |
BD Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration | BD Biosciences | 354248 | Aliquot on ice and store in -20 °C |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
Cell Stimulation Cocktail (500x) (phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and ionomycin) | eBioscience | 00-4970-03 | 1x Final concentration PMA 0.081 μM, ionomycin 1.34 μM |
Clay Adams Autoclip Applier | VetTech Solutions | IN015B | |
Clay Adams Autoclip remover | VetTech Solutions | IN015B | |
Collagenase Type V from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9263 | 2 mg/mL in media |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100mL | |
DMEM High glucose (4.5 g/L) with L-Glutamine | PAA | E15-810 | |
DNase (Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Type II-S) stock 10 mg/mL in 0.15 M NaCl | Sigma-Aldrich | D4513 | Final concentration in digestion media 0.025 mg/mL |
Fixable Viability Dye 506 (FVD506) | eBioscience | 65-0866 | Use at 1:200 in PBS |
Foetal calf-serum (FCS) | GE Healthcare | A15-104 | 10% in RPMI |
Hamilton syringe 700 series, 25 μL volume, 22s gauge needle bevel tip | Fisher Scientific | 10100332 | |
Intracellular Fixation buffer and Intracellular Permeabilisation Buffer | eBioscience | 88-8824-00 | Dilute permeabilisation buffer to 1x in H2O |
Penicillin/streptomycin | PAA | 15140122 | 100 units/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin |
Protein transport inhibitor cocktail (500x) (brefeldin A and monesin) | eBioscience | 00-4980-03 | 1x Final concentration Brefeldin A 10.6 μM, monensin 2 μM |
RPMI-1640 (containing 0.3 g/L Glutamine) | Sigma-Aldrich | R8758 | |
Surgical Scalpel Blade No.10 | Swann-Morton | 0501 | |
Trypsin-EDTA Solution 10x | Sigma-Aldrich | 594-18C | Trypsin (0.1%) EDTA (0.4%) final concentration |
U-bottomed 96 microwell plate | VWR | 734-2080 | |
Universal Cotton Tipped Applicators – 6 inch x 100 | Medisave | UN982 | |
V-bottomed 96 microwell plate | VWR | 735-0184 |