Detta protokoll beskriver den kirurgiska generationen av ortotopiska pankreastumörer och den snabba nedbrytning av nyligen isolerade murin pankreastumörer. Efter matsmältningen kan livskraftiga immun cells populationer användas för ytterligare nedströms analys, inklusive ex vivo stimulering av T-celler för intracellulär cytokindetektion genom flödescytometri.
In vivo modeller av pankreascancer ger ovärderliga verktyg för att studera sjukdomsdynamik, immun infiltration och nya terapeutiska strategier. Den ortotopiska murin modellen kan utföras på stora kohorter av immunkompetenta möss samtidigt, är relativt billigt och bevarar den besläktat vävnad microenvironment. Kvantifiering av T cell infiltration och cytotoxisk aktivitet inom ortotopiska tumörer ger en användbar indikator på en antitumöreffekt svar.
Detta protokoll beskriver metoden för kirurgisk generering av ortotopisk pankreastumörer genom injektion av ett lågt antal uterustransplantat tumörceller återsuspenderas i 5 μl basalmembran direkt i bukspottkörteln. Möss som bär ortotopiska tumörer tar cirka 30 dagar att nå Endpoint, varvid tumörer kan skördas och bearbetas för karakterisering av tumörinfiltrerande T-cellsaktivitet. Snabb enzymatisk nedbrytning med hjälp av kollagenas och DNase gör att en encellig suspension kan extraheras från tumörer. Livskraften och cellytan markörer för immunceller som utvinns ur tumören bevaras; Därför är det lämpligt för flera nedströms applikationer, inklusive flödesassisterad cell sortering av immunceller för odling eller RNA-extraktion, flödescytometri analys av immun cells populationer. Här beskriver vi ex vivo -stimulering av T-cellpopulationer för intracellulär cytokinkvantifiering (IFNγ och TNFα) och degranuleringsaktivitet (CD107a) som ett mått på total cytotoxicitet. Hela-tumör smälter stimulerades med phorbol myristate acetat och ionomycin för 5 h, i närvaro av anti-CD107a antikropp för att upregulate cytokin produktion och degranulering. Tillägget av brefeldin A och monensin för den slutliga 4 h utfördes för att blockera extracellulära transport och maximera cytokin upptäckt. Extra-och intra-cellulär färgning av celler utfördes sedan för flödescytometri analys, där andelen av IFNγ+, TNFα+ och CD107a+ CD4+ och CD8+ T celler kvantifierades.
Denna metod ger en utgångspunkt för att utföra omfattande analys av tumören mikromiljö.
Denna metod detaljer, från start-till-avslut, det kirurgiska förfarandet för att generera ortotopisk pankreastumörer med en minimal mängd av cellulära material och efterföljande snabb dissociation av etablerade tumörer för omfattande flödescytometri analys av immunceller, inklusive ex vivo analys av T-cells funktion.
Pankreascancer duktal adenocarcinom (PDAC) är en aggressiv carcinoma med endast 8% av patienterna överlevande 5 år1. Eftersom mindre än 20% av patienterna är berättigade till kirurgisk resektion2, är färska patientprover inte lättillgängliga för forskning och därmed in vivo -modeller ger viktiga verktyg för att undersöka denna sjukdom. Det finns flera murina modeller av PDAC: ortoämne, subkutan, transgena, intravenös och patient-derived xenograft (PDX), utförligt beskrivs här3. Den neobladder modell som beskrivs här tillåter injektion av uterustransplantat PDAC celler i bukspottkörteln hos immunkompetenta möss. Detta kan utföras i stora kohorter av vildtyp eller muterade möss, och därmed ger en kostnadseffektiv och konsekvent modell för jämförelse av terapeutiska medel. Viktigt, den neobladder modellen ger den besläktat mikromiljö för tumörcelltillväxt och metastaser i våra händer och andra4 till kliniskt relevanta områden (t. ex., levern), vilket gör det mer kliniskt relevant än den subkutana eller kemiskt inducerad modeller. Ortotopiska tumörer Visa viktiga funktioner i PDAC, såsom en stark desmoplastisk reaktion med ett överflöd av fibroblaster och extracellulär matrix deposition5. Transgena modeller av PDAC är guld-standard av murina modell och den mest använda är KPC-modellen, som uttrycker Mutant KRASG12D/+ och Trp53R172H/+ under bukspottkörteln-specifika PDX-1-CRE promotor6. Ytterligare KPC och andra in vivo PDAC modeller granskas här7. KPC-möss utvecklar spontant pankreastumörer med en sjukdomsprogression som troget replikerar egenskaper hos humant PDAC6. Men som för alla transgena modeller är avelsprogrammet kostsamt, tumörprogression varierar och kräver därför ofta stora kohorter av möss. PDX modeller använder patient-derived tumörceller eller bitar som sedan odlas antingen ortotopiskt eller oftare subkutant i immunkomprometterade möss. Xenograft modeller ger användbara verktyg för screening terapeutiska föreningar och redogöra för patientens heterogenitet. Emellertid, de ger inte en komplett immun mikromiljö, vilket begränsar deras tillämpningar8,9.
När etablerad, ortotopiska tumörer tar vanligtvis runt 1 månad eller mer att växa (beroende på cell linjen används) och bilda stora tumörer som lätt kan avbildas med ultraljud eller MRI för att spåra progression och bestämma behandlingseffekt4,5,10. Men en gång i exponentiell tillväxt, den sista fasen av tumörtillväxt kan vara snabb, så de flesta behandlingsregimer påbörjas relativt tidigt (t. ex., 14 dagar)11,12. Immunförsvaret spelar en avgörande roll i tumörutveckling, inklusive i PDAC, som kännetecknas av en immunsuppressiv tumör infiltrera med relativ brist på T-celler och frekvent förekomst av myeloida celler13. En hög förekomst av T-celler i PDAC ger en bättre prognos14,15. Men som enstaka agenter, immunkontrollpunktshämmare som lindrar T-cellsimmunsuppression, såsom anti-CTLA-416 och anti-PD-L117, har inte visat klinisk nytta hos PDAC patienter, troligen eftersom den totala T-cellernas reaktivitet är mycket låg. Emellertid, agenter som Prime T cell svar, såsom anti-CD40, kan övervinna anti-PD-L1/CTLA-4 motstånd18,19 och vaccination med GM-CSF-utsöndring allogena PDAC vaccin (gvax) kan öka immunogeniciteten av PDAC tumörer20, vilket tyder på att förbättra T-cellsvar bildar viktiga terapeutiska Avenue.
Kritisk till en antitumöreffekt T-cellsrespons är erkännandet av tumör-härledda antigener via T-cells receptorn (TCR) och den efterföljande produktionen av cytotoxiska cytokiner och granulat. Medan T-cellernas antigen-erkännande kan bestämmas genom TCR-sekvensering, är denna metod kostsam och tidskrävande. Kvantifiering av tumörinfiltrerande T-cellsundergrupper ger dock en bra indikation på ett antitumoraliskt svar. Ytterligare undersökning av T-cellsaktivitet ex vivo när det gäller degranulering, cytokinproduktion och andra cytotoxiska faktorer ger en djupare funktionell analys. Dessa analyser kan utföras på färska tumörprover och många parametrar för T-cellernas funktion kan mätas snabbt med flödescytometri.
CD8+ och CD4+ T-celler producerar cytokiner såsom Ifnγ och TNFα för att potentiera ett immunsvar21. IFNɣ inducerar MHCI uprekling på målceller, inducerar differentiering och rekrytering av immunceller och aids celldöd. Ifnγ produktion av CD8+ T-celler är väl kännetecknas att vara en del av en antitumöreffekt svar och korrelerar med tumörregression22,23. TNFα är en annan proinflammatorisk cytokin som produceras av både CD8+ och CD4+ T-celler. Det förbättrar TCR-beroende aktivering och spridningen av T-celler, medhjälp den anti-tumoral svar. Vid TCR engagemang, cytotoxiska CD8+ T-celler kan genomgå degranulering, där förformade sekretoriska lysosomer som innehåller cytotoxiska molekyler släpps ut i den immunologiska synapsen att orsaka mål-cell nedbrytning21. Dessa molekyler inkluderar perforin, ett protein som binder till mål cellmembranet, bildar porer som sedan stör membranet integritet och tillåter diffusion21 eller endocytos24 av andra cytotoxiska molekyler, såsom granzym B, direkt i cytoplasman i målcellen. Granzyme B är ett proteas som antar nedbrytningen av flera proteiner inom målcellen, vilket leder till celldöd21. Frisläppandet av sådana molekyler kräver exocytos av endosomer till cellytan, där den endosomala markören CD107a (även känd som LAMP-1) är transitivt införlivas i cellmembranet25.
Mätningen av cytokinsekretion av T-celler kräver isolering genom antingen flödesassisterad cell sortering eller pärlbaserade separations analyser, som inte lätt kan utföras på ett stort antal prover samtidigt. Emellertid, mätning av intracellulära cytokiner kräver inte någon pre-isolering steg och kan enkelt utföras på flera prover på en gång, vilket möjliggör en högre genomströmning strategi. Som cytokiner snabbt utsöndras av T-celler, de intracellulära nivåerna kan vara omöjlig att upptäcka och därmed T-cellen kräver stimulering för att öka basal cytokin produktion. För att bedöma antigendriven cytokinproduktion måste det antigen som erkänns av TCR uppvisas för T-cellen av en primas APC in vitro. I de fall där antigenspecificiteten inte är känd krävs en bred stimulans metod. TCR stimulering kan imicked med anti-CD3/28 pärlor som ger både TCR aktivering och costimulation, som inducerar cytokin produktion och proliferation. Emellertid, ett mer kostnadseffektivt alternativ är användningen av PMA och ionomycin, som tillsammans i stort sett aktivera signalering vägar som leder till syntes och frisättning av intracellulära cytokiner. Specifikt aktiverar PMA proteinkinas C (PKC) och ionomycin höjer intracellulära ca2 + joner, vilket leder till ökad cellsignalering. För att bevara intracellulärt innehåll av cytokiner, denna stimulering kan effektivt kombineras med protein-transport hämmare brefeldin A och monensin, som blockerar proteiner i Golgi och därmed förhindra extracellulär frisättning. Användning av PMA/ionomycin är en väletablerad metod för att stimulera T-celler och det finns ett starkt samband mellan extracellulära-släppta och intracellulära cytokiner26. Stimulering av T-celler med PMA och ionomycin ökar också Lysosomen smuggling till cellmembranet och därmed CD107a blir transitivt integreras på cellytan innan de återvinns i cellen. Genom att inkludera en anti-CD107a antikropp under stimulering, är det möjligt att använda den som en markör för degranulering aktivitet25.
Denna metod smälter snabbt tumörer för att ge en encellig suspension. Vid denna punkt, kan enskilda populationer direkt färgas för flödescytometri eller renas genom nedströms metoder: Flow-Assisted cell sortering eller magnetisk pärla separation. Beredning av en encellig suspension för flödescytometri analys möjliggör hög genomströmning analys av flera immunceller populationer och deras fenotypiska markörer, vilket ger en korrekt kvantifiering av immun cells nummer och fenotyp.
Slutligen, den digestionsprotokoll som beskrivs här förhindrar cell-ytan markörer förlust och upprätthåller immuncellernas lönsamhet, vilket gör att immunceller att genomgå ytterligare cell rening steg och kultur som krävs. Emellertid, denna metod har inte testats för att härleda epitelceller från denna matsmältning.
In vivo modeller av pankreascancer ger ovärderliga verktyg för att förstå sjukdomsprogression och bedöma nya Therapeutics mål3. Den ortotopiska modellen i synnerhet är en kostnadseffektiv och reproducerbar modell som kan tillämpas i stora kohorter av möss samtidigt4,27. Den neobladder modellen ger också den besläktat mikromiljö och intakt immunförsvar för tumörtillväxt, vilket gör det mer lämpligt än den subkutana och PDX-modeller. Emellertid, vi har funnit att vissa delar av immun infiltration kan skilja mellan ortotopisk modell och KPC möss, guldmynt-standard murina modell10. En anledning till detta kan vara den accelererade tumörtillväxt ses i ortotopisk modell. Ytterligare skillnader i densiteten av immun cells undergrupper har beskrivits mellan ortoämnet och subkutana modeller3,28. Därför, även om den transgena KPC-modellen är dyrare och variabel6, bör viktiga fynd verifieras i en liten kohort av KPC-möss där det är möjligt.
Beredningen av tumörceller för ortotopisk kirurgi är ett kritiskt steg i protokollet. Celler ska alltid vara i logg fasen av tillväxt och Mycoplasma-och infektions fria. Ortotopisk kirurgi bör skjutas upp om det finns några farhågor över tumörcelltillväxt. Användningen av basalmembran förbättrar tumör incidens över injicera celler utan det29 och minskar cellläckage och därmed peritonealdialys spridning27. Emellertid, när suspenderade i basalmembranet, tumörceller bör snabbt injiceras (inom 2 timmar) för att undvika någon cellförlust. Antalet tumörceller som krävs för att generera tumörer är sannolikt att cell-line beroende, och en rad cell nummer bör testas (t. ex. från 100 – 100 000) som också kan bestämma tiden för att nå Endpoint. Det är sannolikt att det kommer att finnas en felmarginal när du förbereder 1 000 celler per mus för injektion; Därför, om flera dagar av kirurgi krävs, behandling av grupper bör spridas jämnt över dagar för att kontrollera för batcheffekter. De flesta kirurgiska steg kan ändras beroende på preferenser; emellertid, försiktighet måste vidtas för att inte störa basalmembranet när du byter bukspottkörteln i bukhålan eller stänga peritonealväggen. Basalmembran läckage kan orsaka tumörcelltillväxt på peritonealväggen, som bildar snabbt och kan resultera i att behöva offra djuret tidigare.
Helst, pankreastumörer bör snabbt smälta efter skörd och förberett för ex vivo stimulering omedelbart. Emellertid, detta kanske inte är möjligt om det finns ett stort parti av tumörer att skörda, i detta fall tumörer bör hållas på is och smält i partier. Typ, koncentration och längd av exponering för matsmältningsenzymer har alla visat sig påverka ett stort antal ytmolekyler på immunceller30,31,32. Digestionstiden är också medvetet kort för att begränsa celldöd33. Smält celler kan frysas ned i frys medium för långtidsförvaring. emellertid, vissa cellförlust kommer att inträffa när upptinning. Digestionsprocessen kan vara mindre än optimal om tumör bitarna inte är tillräckligt tärnad innan kollagenase inkubering och detta kommer att vara uppenbart som hårda tumör bitar kommer att finnas kvar i filtret efter matsmältningen. Kollagenaskoncentrationen kan sänkas om man arbetar med friska bukspottkörteln eller tidiga tumörer; rapporter om utvinna friska bukspottskörteln duktal celler använder betydligt lägre koncentrationer34. En hög grad av epitelial celldöd är att förväntas under matsmältningen; men, immunceller bör tolerera processen väl. Alternativa metoder finns för att isolera livskraftiga epitelceller för Organoid tillväxt35 eller för att bevara vävnads arkitektur36.
Ändringar av stimuleringsprotokollet kan göras enkelt, beroende på önskad avläsnings-och immuncell analyseras (t. ex. makrofager eller B-celler). Användning av panstimuleringsmedel PMA/ionomycin diskriminerar inte för TCR-antigen-specificitet, vilket gör det användbart när antigenet inte är känt. Dock är produktionen av IFNɣ nära förknippad med TCR Engagement37 och både IFNɣ och TNFα produktion är kritiska i PDAC antitumöreffekt svar38. PMA/ionomycin stimulering återspeglar den maximala kapaciteten hos T-celler att producera cytokiner, som kan eller inte kan produceras av T-celler i tumören mikromiljö. Endogena produktionen kan mätas utan behov av stimulering; emellertid, nivåer kan vara mycket lägre eller omätbara. Det finns alternativa metoder för att stimulera T-celler: anti-CD3/28-belagda pärlor, som också inte kräver antigen eller även andra immunceller populationer. Fördelen med denna metod är att tillåta kvantifiering av cytokin produktion av specifika T cell delmängder utan behov av separationsmetoder. Andra markörer för cytotoxicitet (granzym B och perforin A), aktivitet (IL-2) eller immunsuppression (IL-10) kan också tillsättas21. Emellertid, hög kvalitet flödescytometri antikroppar är inte tillgängliga för att upptäcka alla cytokiner och faktorer av intresse. Därför, om det finns andra tillämpningar såsom ELISA krävs stimulering kan utföras utan införandet av brefeldin A/monensin, vilket gör att cytokin release i supernatanten. Emellertid, av anmärkning, detta kommer att tillåta total cell cytokin release och det kommer inte att vara möjligt att avgöra vilken cellpopulationer bidragit.
Ifnγ-produktion är ett dominerande inslag i en antitumöreffekt T-cellsrespons, som ofta används som ersättning för TCR-antigen-igenkänning37,38. Andra in vivo metoder som mer exakt definierar antigen-specifika svar utnyttja tumörceller som uttrycker ett känt antigen, såsom ovalbumin eller SV40. Universal antigen kan sedan användas ex vivo för att testa T cell igenkänning eller i kombination med en TCR-begränsad värdmus. Alternativt, där antigenet är okänt, kan kvantifiering av T-cellsklon expansion utföras genom bulk-TCR-sekvensering, eller mer nyligen encellig TCR-sekvensering39,40. För att till fullo förstå tillståndet i den intratumorala T-cellsrespons, bör markörer som indikerar utmattning eller hämmande receptorer också mätas inklusive: CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM3, 2B4. Samt markörer för effektort celler (CD44Hi, CD62Lo) och proliferativ aktivitet, Ki67+ eller csfe utspädning41,42,43,44. Sammantaget, den neobladder modellen ger en användbar plattform för att snabbt testa terapeutiska strategier, i synnerhet som kan modulera den antitumöreffekt T-cell svar, som kan sedan valideras på en mindre kohort av transgena, KPC, möss.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Animal Technician service och Dr Alzbeta Talarovicova (Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, London, Storbritannien) för deras hjälp under ortotopisk kirurgi. Vi skulle också vilja tacka Dr Jennifer Morton (Beatson Institute for Cancer Research, Glasgow, Storbritannien) för hennes vägledning i kirurgisk teknik, Dr Cristina Ghirelli (Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, London, Storbritannien) för hennes råd om tumör matsmältning och Dr Fabienne McClanahan (Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, London, Storbritannien) för hennes råd om ex vivo T cell stimulering protokoll. Vi vill också tacka Medicinska forskningsrådet (MRC), pankreascancer forskningsfonden (PCFR) och äggstockscancer åtgärder som finansierade denna forskning.
6/0 gauge coated vicryl absorbable sutures | Ethicon | W9500T | |
70 μm pore-size cell strainer | Fisher Scientific | 11597522 | |
9 mm Clay Adams clips | VetTech Solutions | IN015A | |
anti-CD107a PE (clone 1D4B) | Biolegend | 121612 | 1:100 to culture media |
anti-CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Use at final dilution 1:200 |
anti-CD3 PerCP eFluor710 (clone 17A2) | Biolegend | 46-0032 | Use at final dilution 1:50 |
anti-CD4 FITC (clone GK1.5) | eBioscience | 11-0041 | Use at final dilution 1:100 |
anti-CD45 Brilliant Violet 605 (clone 30-F11) | Biolegend | 103140 | Use at final dilution 1:200 |
anti-CD8 Brilliant Violet 421 (clone 53-6.7) | Biolegend | 100738 | Use at final dilution 1:100 |
anti-IFN-gamma PE/Cy7 (clone XMG1.2) | Biolegend | 505826 | Use at final dilution 1:50 |
anti-TNF-alpha Alexa Fluor 647 (clone MP6-X) | Biolegend | 506314 | Use at final dilution 1:50 |
BD Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration | BD Biosciences | 354248 | Aliquot on ice and store in -20 °C |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
Cell Stimulation Cocktail (500x) (phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and ionomycin) | eBioscience | 00-4970-03 | 1x Final concentration PMA 0.081 μM, ionomycin 1.34 μM |
Clay Adams Autoclip Applier | VetTech Solutions | IN015B | |
Clay Adams Autoclip remover | VetTech Solutions | IN015B | |
Collagenase Type V from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9263 | 2 mg/mL in media |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100mL | |
DMEM High glucose (4.5 g/L) with L-Glutamine | PAA | E15-810 | |
DNase (Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Type II-S) stock 10 mg/mL in 0.15 M NaCl | Sigma-Aldrich | D4513 | Final concentration in digestion media 0.025 mg/mL |
Fixable Viability Dye 506 (FVD506) | eBioscience | 65-0866 | Use at 1:200 in PBS |
Foetal calf-serum (FCS) | GE Healthcare | A15-104 | 10% in RPMI |
Hamilton syringe 700 series, 25 μL volume, 22s gauge needle bevel tip | Fisher Scientific | 10100332 | |
Intracellular Fixation buffer and Intracellular Permeabilisation Buffer | eBioscience | 88-8824-00 | Dilute permeabilisation buffer to 1x in H2O |
Penicillin/streptomycin | PAA | 15140122 | 100 units/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin |
Protein transport inhibitor cocktail (500x) (brefeldin A and monesin) | eBioscience | 00-4980-03 | 1x Final concentration Brefeldin A 10.6 μM, monensin 2 μM |
RPMI-1640 (containing 0.3 g/L Glutamine) | Sigma-Aldrich | R8758 | |
Surgical Scalpel Blade No.10 | Swann-Morton | 0501 | |
Trypsin-EDTA Solution 10x | Sigma-Aldrich | 594-18C | Trypsin (0.1%) EDTA (0.4%) final concentration |
U-bottomed 96 microwell plate | VWR | 734-2080 | |
Universal Cotton Tipped Applicators – 6 inch x 100 | Medisave | UN982 | |
V-bottomed 96 microwell plate | VWR | 735-0184 |