Bu protokol ortotopik pankreas tümörlerinin cerrahi nesil ve taze izole mürin pankreas tümörlerinin hızlı sindirim açıklar. Sindirimden sonra, canlı bağışıklık hücresi popülasyonları daha fazla downstream analizi için kullanılabilir, akış sitometri ile hücre içi sitokin tespiti için T hücrelerinin ex vivo stimülasyon dahil.
Pankreas kanseri in vivo modelleri hastalık dinamikleri, immün infiltrasyon ve yeni tedavi stratejileri çalışma için paha biçilmez araçlar sağlar. Ortotopik mürin modeli aynı anda immünobeceriksiz farelerin büyük kohortlar üzerinde yapılabilir, nispeten ucuz ve cognate doku mikroortamı korur. Ortotopik tümörlerde T hücre infiltrasyonu ve sitotoksik aktivitenin sayısallaştırılması antitümöral yanıtın yararlı bir göstergesidir.
Bu protokol, 5 μL bazal membranda doğrudan pankreasa singenik tümör hücrelerinin az sayıda enjeksiyon ulaştırılması ile ortotopik pankreas tümörlerinin cerrahi üretimi için metodolojiyi açıklamaktadır. Ortotopik tümörler taşıyan farelerin uç noktaya ulaşması yaklaşık 30 gün sürer, bu noktada tümörler hasat edilebilir ve tümöre infiltrasyon yapan T hücre aktivitesinin karakterizasyonu için işlenebilir. Kollajenaz ve DNase kullanılarak hızlı enzimatik sindirim tümörlerden tek hücreli süspansiyon ayıklanmasına olanak sağlar. Tümörden çıkarılan bağışıklık hücrelerinin canlılığı ve hücre yüzey ilerleçleri korunur; bu nedenle, kültür veya RNA ekstraksiyonu için bağışıklık hücrelerinin akış destekli hücre sıralama, bağışıklık hücre popülasyonlarının akış sitometri analizi de dahil olmak üzere birden fazla downstream uygulamaları için uygundur. Burada, hücre içi sitokin nicelliği (IFNγ ve TNFα) için T hücre popülasyonlarının ex vivo stimülasyonunu ve degranülasyon aktivitesini (CD107a) genel sitotoksisitenin bir ölçüsü olarak açıklıyoruz. Tüm tümör sindirimi sitokin üretimini ve degranülasyonu düzenlemek için anti-CD107a antikor varlığında 5 saat boyunca phorbol mirüstate asetat ve iyonomisin ile uyarıldı. Son 4 saat için brefeldin A ve monensin ilavesi ekstrasellüler taşımayı engellemek ve sitokin tespitini en üst düzeye çıkarmak için yapıldı. Daha sonra akış sitometri analizi için hücrelerin ekstra ve hücre içi boyanması yapıldı ve IFNγ+, TNFα+ ve CD107a+ CD4+ ve CD8+ T hücrelerinin oranı ölçüldü.
Bu yöntem tümör mikroortamının kapsamlı analizini yapmak için bir başlangıç temeli sağlar.
Bu yöntem ayrıntıları, start-to-finish, hücresel malzeme nin en az miktarda kullanarak ortotopik pankreas tümörleri oluşturmak için cerrahi prosedür ve bağışıklık hücresi popülasyonlarının kapsamlı akış sitometri analizi için kurulan tümörlerin sonraki hızlı dissosiyatasyon, T hücre fonksiyonunun ex vivo analizi de dahil olmak üzere.
Pankreas duktal adenokarsinom (PDAC) 5 yıl hayatta kalan hastaların sadece % 8’i ile agresif bir karsinomdur1. Hastaların %20’sinden azı cerrahi rezeksiyon için uygunolduğundan,taze hasta örnekleri araştırma için kolayca erişilebilir değildir ve bu nedenle in vivo modelleri bu hastalığı araştırmak için gerekli araçları sağlar. PDAC’ın birden fazla mürin modeli vardır: ortotopik, subkutan, transgenik, intravenöz ve hasta kaynaklı ksenogreft (PDX), burada yaygın olarak tanımlanmış3. Burada açıklanan ortotopik model immünobeceriksiz farelerin pankreas içine syngeneic PDAC hücrelerinin enjeksiyonu sağlar. Bu vahşi tip veya mutant farelerin büyük kohortlar yapılabilir, ve böylece terapötik ajanların karşılaştırılması için uygun maliyetli ve tutarlı bir model sağlar. Daha da önemlisi, ortotopik model tümör hücre büyümesi için cognate mikroortam sağlar ve elimizde metastazlar ve diğerleri4 klinik olarak ilgili sitelere (örneğin, karaciğer), daha klinik olarak subkutan veya kimyasal kaynaklı modeller daha alakalı hale. Ortotopik tümörler PDAC temel özellikleri görüntülemek, fibroblastlar ve ekstrasellüler matriks birikimi bir bolluk ile güçlü bir desmoplastik reaksiyon gibi5. PDAC transgenik modelleri murine modelinin altın standart ve en yaygın kullanılan KPC modeli, mutant KrasG12D / + ve Trp53R172H / + pankreas özgü Pdx-1-Cre promoteraltındaifade 6. Ek KPC ve diğer in vivo PDAC modelleriburada7 gözden geçirilir. KPC fareler kendiliğinden sadakatle insan PDAC özellikleri çoğaltır bir hastalık ilerlemesi ile pankreas tümörleri geliştirmek6. Ancak, tüm transgenik modellerde olduğu gibi, üreme programı pahalıdır, tümör ilerlemesi değişkendir ve bu nedenle genellikle büyük fare kohortları gerektirir. PDX modelleri hasta kaynaklı tümör hücreleri veya daha sonra ya ortonik ya da daha sık subkutan bağışıklık farelerde yetiştirilen adet kullanın. Ksenogreft modelleri terapötik bileşiklerin taranması için yararlı araçlar sağlar ve hasta heterojenliğini hesaba katar. Ancak, böylece uygulamaları8,9sınırlayan, tam bir bağışıklık mikroortamı sağlamaz.
Kurulduktan sonra, ortotopik tümörler genellikle büyümek için yaklaşık 1 ay veya daha fazla sürer (kullanılan hücre hattına bağlı olarak) ve kolayca ultrason veya MRI ile progresyon izlemek ve tedavi etkinliğini belirlemek için görüntülenebilir büyük tümörler oluşturmak4,5,10. Ancak, bir kez üstel büyüme, tümör büyümesinin son aşaması hızlı olabilir, bu yüzden en tedavi rejimleri nispeten erken başlar (örneğin, 14 gün)11,12. Bağışıklık sistemi tümör gelişiminde kritik bir rol oynar, PDAC dahil, hangi bir immünsupresif tümör t hücrelerinin göreceli azlığı ve miyeloid hücrelerin sık varlığı ile infiltrasyon ile karakterizedir13. PDAC T hücrelerinin yüksek varlığı daha iyi bir prognozverir 14,15. Ancak, tek ajanlar olarak, anti-CTLA-416 ve anti-PD-L117gibi T hücre immünsupresyonu rahatlatmak bağışıklık kontrol noktası inhibitörleri, PDAC hastalarında klinik fayda göstermedi, genel T hücre reaktivitesi çok düşük olduğu için büyük olasılıkla. Ancak, ajanlar, anti-CD40 gibi prime T hücre yanıtları, anti-PD-L1/CTLA-4 direnci üstesinden gelebilir18,19 ve GM-CSF salgılayan allojenik PDAC aşısı ile aşılama (GVAX) PDAC tümörlerin immünjenite artırabilir20, T hücre formları önemli terapötik yol gösterir arttırıcı gösteren.
Antitümöral T hücre yanıtı için kritik t-hücre reseptörü (TCR) ve sitotoksik sitokinler ve granüllerin sonraki üretimi yoluyla tümör kaynaklı antijenlerin tanınmasıdır. T hücre antijen tanıma TCR dizilimi ile belirlenebilir iken, bu yaklaşım pahalı ve zaman alıcıdır. Ancak, tümör-infiltrasyon T hücre alt kümelerinin nicel bir anti-tümöral yanıt iyi bir göstergesi sağlar. Degranülasyon, sitokin üretimi ve diğer sitotoksik faktörler açısından T hücre aktivitesi ex vivo daha ileri incelenmesi daha derin bir fonksiyonel analiz sağlar. Bu tahliller taze tümör örnekleriüzerinde yapılabilir ve T hücre fonksiyonunun birçok parametre akışı sitometri ile hızlı bir şekilde ölçülebilir.
CD8+ ve CD4+ T hücreleri bir bağışıklık yanıtı güçlendirmek için IFNγ ve TNFα gibi sitokinler üretmek21. IFNa, hedef hücrelerde MHCI upregülasyonuna neden olur, bağışıklık hücrelerinin farklılaşmasına ve işe alınmasına neden olur ve hücre ölümüne yardımcı olur. CD8+ T hücreleri tarafından IFNγ üretimi antitümöral yanıtın bir parçası olarak iyi karakterizedir ve tümör regresyonu ile ilişkilidir22,23. TNFα, CD8+ ve CD4+ T hücreleri tarafından üretilen başka bir proinflamatuar sitokindir. Bu TCR bağımlı aktivasyon ve T hücrelerinin çoğalmasını artırır, anti-tümöral yanıt yardımcı. TCR katılımı üzerine, sitotoksik CD8+ T hücreleri degranülasyon geçirebilir, sitotoksik moleküller içeren önceden oluşturulmuş sekresör lizozomlar hedef hücre bozulmasına neden olmak için immünolojik sinaps içine serbest bırakılır21. Bu moleküller Perforin içerir, hedef hücre zarına bağlanan bir protein, daha sonra membran bütünlüğünü bozan ve difüzyon sağlayan21 veya endocytoz24 diğer sitotoksik moleküllerin, Granzyme B gibi, doğrudan hedef hücrenin sitoplazma içine gözenekler oluşturan. Granzyme B, hedef hücre içindeki birden fazla proteinin bozulmasını öngören ve hücre ölümüne yol açan bir proteazdır21. Bu tür moleküllerin salınımı hücre yüzeyine endozozomların ekzositoz gerektirir, endozomal marker CD107a (ayrıca LAMP-1 olarak da bilinir) geçici hücre zarına dahil edilir25.
Sitokin salgısının T hücreleri tarafından ölçülmesi, aynı anda çok sayıda numuneüzerinde kolayca yapılamayacak akış destekli hücre sıralaması veya boncuk bazlı ayırma tahlilleri ile izolasyonlarını gerektirir. Ancak, hücre içi sitokinlerin ölçümü herhangi bir ön izolasyon adımı gerektirmez ve aynı anda birden fazla numune üzerinde kolayca yapılabilir, böylece daha yüksek işlem yaklaşımı sağlar. Sitokinler hızla T hücreleri tarafından salgılanır gibi, hücre içi düzeyleri tespit edilemez olabilir ve böylece T hücresi bazal sitokin üretimini artırmak için stimülasyon gerektirir. Antijen güdümlü sitokin üretimini değerlendirmek için, TCR tarafından tanınan antijen, astarlı bir APC in vitro ile T hücresine sunulmalıdır. Antijen özgüllüğünün bilinmediği durumlarda geniş bir stimülasyon yaklaşımı gereklidir. TCR stimülasyon sitokin üretimi ve proliferasyonu neden hem TCR aktivasyonu ve costimulation sağlayan anti-CD3/28 boncukkullanılarak taklit edilebilir. Ancak, daha uygun maliyetli bir alternatif PMA ve iyonomisin kullanımı, birlikte geniş hücre içi sitokinlerin sentezi ve salınımına yol sinyal yollarını etkinleştirmek. Özellikle, PMA protein kinaz C aktive (PKC) ve iyonomisin hücre içi Cayükseltir 2 + iyonları, artan hücre sinyaline yol açan. Sitokinlerin hücre içi içeriğini korumak için, bu stimülasyon etkili protein taşıma inhibitörleri brefeldin A ve monensin ile kombine edilebilir, Hangi Golgi proteinleri blok ve böylece ekstrasellüler salınımını önlemek. PMA/ionomisin kullanımı T hücrelerini uyarmak için iyi kurulmuş bir yöntemdir ve hücre dışı salınımlı ve hücre içi sitokinler arasında güçlü bir korelasyon vardır26. PmA ve iyonomisin ile T hücrelerinin uyarılması da hücre zarına lizom ticaretini artırır ve böylece CD107a hücre içine geri dönüştürülmeden önce hücre yüzeyine geçici olarak entegre olur. Stimülasyon sırasında bir anti-CD107a antikor dahil edilerek, degranülasyon aktivitesi25bir belirteç olarak kullanmak mümkündür.
Bu yöntem, tek hücreli süspansiyon sağlamak için tümörleri hızla sindirir. Bu noktada, bireysel popülasyonlar doğrudan akış sitometrisi için lekelenebilir veya aşağı akım yöntemleri ile saflaştırılmış olabilir: akış destekli hücre sıralama veya manyetik boncuk ayırma. Akış sitometri analizi için tek hücreli süspansiyon hazırlanması, birden fazla bağışıklık hücresi popülasyonları ve bunların fenotipik belirteçlerinin yüksek iş lenme analizine olanak sağlayarak, bağışıklık hücre numarası ve fenotipin doğru bir niceliğini sağlar.
Son olarak, burada açıklanan sindirim protokolü hücre yüzeyi belirteçleri kaybını önler ve bağışıklık hücresi canlılığını korur, bağışıklık hücrelerinin daha fazla hücre saflaştırma adımları ve kültür gerektiği gibi geçmesine izin. Ancak, bu yöntem bu sindirim epitel hücreleri elde etmek için test edilmemiştir.
Pankreas kanseri in vivo modelleri hastalığın ilerlemesini anlamak ve yeni terapötik hedefleri değerlendirmek için paha biçilmez araçlar sağlamak3. Özellikle ortotopik model aynı anda farelerin büyük kohortlarda uygulanabilir bir maliyet-etkin ve tekrarlanabilir bir modeldir4,27. Ortotopik model aynı zamanda tümör büyümesi için cognate mikroçevre ve bozulmamış bağışıklık sistemi sağlar, daha deri altı ve PDX modelleri daha uygun hale. Ancak, biz bağışıklık infiltrasyon bazı unsurları ortotopik model ve KPC fareler arasında farklılık olabilir bulduk, altın standart murine modeli10. Bunun bir nedeni ortotopik modelde görülen hızlandırılmış tümör büyümesi olabilir. Ortotopik ve deri altı modelleri arasında bağışıklık hücresi alt kümelerinin yoğunluğunda daha fazla fark lar tanımlanmıştır3,28. Bu nedenle, transgenik KPC modeli daha pahalı ve değişken6olmasına rağmen, anahtar bulgular mümkünse KPC farelerküçük bir kohort doğrulanmalıdır.
Ortotopik cerrahi için tümör hücrelerinin hazırlanması protokolün kritik bir adımdır. Hücreler her zaman büyüme ve mikoplazma- ve enfeksiyon-free günlük aşamasında olmalıdır. Tümör hücre büyümesi ile ilgili herhangi bir endişe varsa ortotopik cerrahi ertelenmelidir. Bazal membran kullanımı onsuz enjekte hücreleri üzerinde tümör insidansı oranını artırır29 ve hücre kaçağı azaltır ve böylece periton yayılmasınıazaltır 27. Ancak, bir kez bazal membran askıya, tümör hücreleri hızla enjekte edilmelidir (içinde 2 saat) herhangi bir hücre kaybını önlemek için. Tümör oluşturmak için gerekli tümör hücrelerinin sayısı hücre-line bağımlı olması muhtemeldir, ve hücre numaraları bir dizi test edilmelidir (örneğin, 100 -100.000) hangi da bitiş noktasına ulaşmak için zaman belirleyebilir. Enjeksiyon için fare başına 1.000 hücre hazırlarken bir hata payı olması muhtemeldir; bu nedenle, cerrahi birden fazla gün gerekli ise, grupların tedavisi toplu etkileri kontrol etmek için gün boyunca eşit olarak yayılmalıdır. Çoğu cerrahi adım tercihe bağlı olarak değiştirilebilir; ancak, karın boşluğunda pankreas yerine veya periton duvarı kapatArak bodrum membran rahatsız değil dikkatli olunmalıdır. Bazal membran sızıntısı periton duvarında tümör hücresi büyümesine neden olabilir, hangi hızla form ve daha erken hayvan kurban neden olabilir.
İdeal olarak, pankreas tümörleri hızla hasat sonrası sindirilir ve hemen ex vivo stimülasyon için hazırlanmalıdır. Ancak, hasat için tümörlerin büyük bir toplu varsa bu mümkün olmayabilir, Bu durumda tümörler buz üzerinde tutulmalıdır ve toplu olarak sindirilir. Türü, konsantrasyonu ve sindirim enzimlerine maruz kalma uzunluğu tüm bağışıklık hücreleri üzerinde yüzey moleküllerinin çok sayıda etkilediği gösterilmiştir30,31,32. Sindirim süresi de kasıtlı hücre ölümü sınırlamak için kısa33. Sindirilmiş hücreler uzun süreli depolama için dondurucu ortamda dondurulabilir; ancak, bazı hücre kaybı zaman erime meydana gelecektir. Tümör parçaları kollajenaz kuluçka önce yeterince doğranmış değilse sindirim süreci optimal daha az olabilir ve sert tümör parçaları sindirim sonrası filtre kalacak gibi bu belirgin olacaktır. Kollajenaz konsantrasyonu sağlıklı pankreas veya erken evre tümörler ile çalışıyorsa azaltılabilir; sağlıklı pankreas duktal hücrelerinin ayıklanması raporları önemli ölçüde daha düşük konsantrasyonlarda kullanın34. Epitel hücre ölümü yüksek derecede sindirim sırasında beklenebilir; ancak, bağışıklık hücreleri de süreci tolere etmelidir. Organoid büyüme35 için canlı epitel hücrelerini izole etmek veya doku mimarisini korumak için alternatif yöntemler vardır36.
Stimülasyon protokolünde yapılan değişiklikler, istenilen okuma ve bağışıklık hücresi analizlerine (örn. makrofajlar veya B hücreleri) bağlı olarak kolayca yapılabilir. Pan-stimülasyon reaktiflerinin kullanımı PMA/ionomisin TCR-antijen özgüllüğü için ayrımcılık yapmaz, antijen bilinmediğinde yararlı olur. Ancak IFNa üretimi TCR engagement37 ile yakından ilişkilidir ve PDAC antitümöral yanıtlarında hem IFNa hem de TNFα üretimi kritiktir38. PMA/ionomisin stimülasyonu, tümör mikroortamındaki T hücreleri tarafından üretilebilen veya üretilmeyebilen Sitokin ler üretmek için T hücrelerinin maksimal kapasitesini yansıtır. Endojen üretim uyarılmaya gerek kalmadan ölçülebilir; ancak, düzeyleri çok daha düşük veya tespit edilemez olabilir. T hücrelerini uyarmak için alternatif yöntemler vardır: anti-CD3/28 kaplı boncuklar, aynı zamanda antijen veya gerçekten diğer bağışıklık hücresi popülasyonları gerektirmez. Bu yöntemin yararı, ayırma yöntemlerine gerek kalmadan belirli T hücre alt kümeleri ile sitokin üretiminin niceleştirilmesine olanak sağlamaktır. Sitotoksisite diğer belirteçleri (granzyme B ve Perforin A), aktivite (IL-2) veya immünsupresyon (IL-10) de eklenebilir21. Ancak, yüksek kaliteli akış sitometri antikorları tüm sitokinler ve ilgi faktörleri tespit etmek için mevcut değildir. Bu nedenle, ELISA gibi gerekli diğer uygulamalar varsa stimülasyon brefeldin A/ monensin dahil edilmeden yapılabilir, supernatant içine sitokin salınımını sağlayan. Ancak, not, bu toplam hücre sitokin salınımı izin verecek ve hangi hücre popülasyonları katkıda belirlemek mümkün olmayacaktır.
IFNγ üretimi bir antitümöral T hücre yanıtı baskın bir özelliğidir, genellikle TCR-antijen tanıma için bir yedek olarak kullanılan37,38. Antijene özgü yanıtları daha doğru bir şekilde tanımlayan diğer in vivo yöntemler, Ovalbumin veya SV40 gibi bilinen bir antijeni ifade eden tümör hücrelerini kullanır. Evrensel antijen daha sonra T hücre tanımasını test etmek için veya TCR ile sınırlı ana fare ile birlikte ex vivo kullanılabilir. Alternatif olarak, antijen bilinmiyorsa, T hücreli klonal genişlemenin nicelleştirilmesi toplu-TCR dizilimi veya daha yakın zamanda tek hücreli TCR dizilimi ile gerçekleştirilebilir39,40. İntratümöral T hücre yanıtının durumunu tam olarak anlamak için, ayrıntılı veya inhibitör reseptörleri gösteren belirteçler de şu şekilde ölçülmelidir: CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM3, 2B4. Yanı sıra efektör T hücrelerinin belirteçleri (CD44hi, CD62lo) ve proliferatif aktivite, Ki67+ veya CSFE seyreltme41,42,43,44. Genel olarak, ortotopik model hızla tedavi stratejileri test etmek için yararlı bir platform sağlar, özellikle antitümöral T-hücre yanıtı modüle edebilir, daha sonra transgenik daha küçük bir kohort üzerinde doğrulanabilir, KPC, fareler.
The authors have nothing to disclose.
Hayvan Teknisyeni Servisi’ne ve Dr. Alzbeta Talarovicova’ya (Barts Kanser Enstitüsü, Londra Queen Mary Üniversitesi, Londra, İngiltere) ortotopik cerrahi sırasında ki yardımları için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr Jennifer Morton (Beatson Institute for Cancer Research, Glasgow, İngiltere) cerrahi tekniği, Dr Cristina Ghirelli (Barts Kanser Enstitüsü, Queen Mary University of London, Londra, İngiltere) tümör sindirim ve Dr Fabienne McClanahan (Barts Kanser Enstitüsü, Londra Queen Mary Üniversitesi, İngiltere) onun tavsiye için ekstrem T hücre stimülasyonu protokolleri ile ilgili onun tavsiye için onun rehberlik için teşekkür etmek istiyorum. Biz de Tıbbi Araştırma Konseyi (MRC), Pankreas Kanseri Araştırma Fonu (PCFR) ve Yumurtalık Kanseri Eylem bu araştırma finanse teşekkür etmek istiyorum.
6/0 gauge coated vicryl absorbable sutures | Ethicon | W9500T | |
70 μm pore-size cell strainer | Fisher Scientific | 11597522 | |
9 mm Clay Adams clips | VetTech Solutions | IN015A | |
anti-CD107a PE (clone 1D4B) | Biolegend | 121612 | 1:100 to culture media |
anti-CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Use at final dilution 1:200 |
anti-CD3 PerCP eFluor710 (clone 17A2) | Biolegend | 46-0032 | Use at final dilution 1:50 |
anti-CD4 FITC (clone GK1.5) | eBioscience | 11-0041 | Use at final dilution 1:100 |
anti-CD45 Brilliant Violet 605 (clone 30-F11) | Biolegend | 103140 | Use at final dilution 1:200 |
anti-CD8 Brilliant Violet 421 (clone 53-6.7) | Biolegend | 100738 | Use at final dilution 1:100 |
anti-IFN-gamma PE/Cy7 (clone XMG1.2) | Biolegend | 505826 | Use at final dilution 1:50 |
anti-TNF-alpha Alexa Fluor 647 (clone MP6-X) | Biolegend | 506314 | Use at final dilution 1:50 |
BD Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration | BD Biosciences | 354248 | Aliquot on ice and store in -20 °C |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
Cell Stimulation Cocktail (500x) (phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and ionomycin) | eBioscience | 00-4970-03 | 1x Final concentration PMA 0.081 μM, ionomycin 1.34 μM |
Clay Adams Autoclip Applier | VetTech Solutions | IN015B | |
Clay Adams Autoclip remover | VetTech Solutions | IN015B | |
Collagenase Type V from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9263 | 2 mg/mL in media |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100mL | |
DMEM High glucose (4.5 g/L) with L-Glutamine | PAA | E15-810 | |
DNase (Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Type II-S) stock 10 mg/mL in 0.15 M NaCl | Sigma-Aldrich | D4513 | Final concentration in digestion media 0.025 mg/mL |
Fixable Viability Dye 506 (FVD506) | eBioscience | 65-0866 | Use at 1:200 in PBS |
Foetal calf-serum (FCS) | GE Healthcare | A15-104 | 10% in RPMI |
Hamilton syringe 700 series, 25 μL volume, 22s gauge needle bevel tip | Fisher Scientific | 10100332 | |
Intracellular Fixation buffer and Intracellular Permeabilisation Buffer | eBioscience | 88-8824-00 | Dilute permeabilisation buffer to 1x in H2O |
Penicillin/streptomycin | PAA | 15140122 | 100 units/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin |
Protein transport inhibitor cocktail (500x) (brefeldin A and monesin) | eBioscience | 00-4980-03 | 1x Final concentration Brefeldin A 10.6 μM, monensin 2 μM |
RPMI-1640 (containing 0.3 g/L Glutamine) | Sigma-Aldrich | R8758 | |
Surgical Scalpel Blade No.10 | Swann-Morton | 0501 | |
Trypsin-EDTA Solution 10x | Sigma-Aldrich | 594-18C | Trypsin (0.1%) EDTA (0.4%) final concentration |
U-bottomed 96 microwell plate | VWR | 734-2080 | |
Universal Cotton Tipped Applicators – 6 inch x 100 | Medisave | UN982 | |
V-bottomed 96 microwell plate | VWR | 735-0184 |