Isolering av voksen Human dermal fibroblaster fra abdominal hud og generering av indusert Pluripotent stamceller ved hjelp av en ikke-integrering metode

Summary

Cell omprogrammering krever innføring av nøkkel gener, som regulerer og opprettholder pluripotent celle tilstand. Protokollen beskrevet gjør det mulig dannelsen av indusert Pluripotent stamceller (iPSCs) kolonier fra menneskelig dermal fibroblaster uten viral/integrere metoder, men bruker ikke-modifisert RNAs (NM-RNAs) kombinert med immune Evasion faktorer redusere cellulære forsvar mekanismer.

Abstract

Indusert Pluripotent stamceller (iPSCs) kan betraktes, til dags dato, en lovende kilde til pluripotent celler for forvaltningen av tiden botemiddel sykdommer, for rekonstituering og regenerering av skadde vev og for utvikling av nye legemidler. Til tross for alle fordelene knyttet til bruk av iPSCs, for eksempel lav risiko for avvisning, den minsket etiske problemstillinger, og muligheten til å få dem fra både unge og gamle pasienter uten noen forskjell i deres omprogrammering potensial, problemer med å overvinne er fortsatt mange. Faktisk celle omprogrammering utført med viral og integrere virus kan føre til infeksjoner og innføring av nødvendige gener kan indusere en genomisk ustabilitet i mottaker cellen, svekke deres bruk i klinikken. Spesielt er det mange bekymringer om bruk av c-myC genet, godt kjent fra flere studier for sin mutasjon-inducing aktivitet. Fibroblaster har dukket opp som egnet celle befolkning for mobilnettet omprogrammering som de er enkle å isolere og kultur og høstes av en minimalt invasiv hud punch biopsi. Protokollen som beskrives her gir en detaljert steg-for-steg beskrivelse av hele prosedyren, fra utvalgs behandling for å oppnå cellekulturer, valg av reagenser og forsyninger, rengjøring og forberedelser, til celle omprogrammering ved hjelp av en kommersiell ikke-modifisert RNAs (NM-RNAs)-basert omprogrammering sett. Den valgte omprogrammering Kit tillater en effektiv omprogrammering av menneskelig dermal Fibroblast til iPSCs og små kolonier kan sees så tidlig som 24 timer etter den første transfeksjoner, selv med modifikasjoner med hensyn til standarddata arket. Den omprogrammering prosedyren som brukes i denne protokollen gir fordelen av en trygg omprogrammering, uten risiko for infeksjoner forårsaket av viral vektor-baserte metoder, reduserer cellulære forsvarsmekanismer, og tillater generering av Xeno iPSCs, alle kritiske funksjoner som er obligatoriske for videre kliniske anvendelser.

Introduction

Cell omprogrammering representerer en ny teknologi for å transformere hver somatiske celle i kroppen til en pluripotent stilk cellen, kjent som iPSC¹. Muligheten for omprogrammering en voksen somatiske celle tilbake til en pluripotent og udifferensierte staten har overvunnet grensene pålagt av dårlig tilgjengelighet og etiske problemstillinger knyttet til bruk av pluripotent celler, tidligere bare derivable fra menneskelige embryo (embryonale stamceller eller ESC)^2,3,4. I 2006 gjennomførte Kazutoshi Takahashi og Shinya Yamanaka en banebrytende studie som oppnådde den første konverteringen av voksne somatiske celler fra huden til pluripotent celler ved kunstig å legge til fire spesifikke gener (Oct4, Sox2, Klf4, c-myC)⁵. Et år senere, arbeidet utført i Thomson laboratorium førte til vellykket omprogrammering av somatiske celler i iPSCs av Transduction av en annen kombinasjon av fire gener (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)⁶.

iPSCs tilbyr en rekke muligheter til forskere og forskere i ulike felt, for eksempel regenererende medisin og farmakologi, er en utmerket plattform for å studere og behandle ulike sykdommer sammen med en genotypisk refleksjon av egenskapene til pasienten de er avledet fra. Bruken av iPSCs gir flere fordeler, inkludert: den reduserte risikoen for immunrespons på grunn av en helt autologous opprinnelse av celler; muligheten for å skape et celle bibliotek, et viktig verktøy for å forutsi responsen til nye legemidler og deres bivirkninger, som de er i stand til å kontinuerlig selv fornye og generere ulike celletyper; og muligheten til å utvikle en tilpasset tilnærming for Drug Administration^7,8,9.

Ulike teknikker er kjent i dag, for å indusere uttrykk for omprogrammering faktorer og de er inkludert i to hovedkategorier: ikke-viral og viral vektor-baserte metoder^10,11,12,13. Ikke-viral metoder inkluderer mRNA transfeksjoner, miRNA infeksjon/transfeksjoner, PiggyBac, minicircle vektorer og episomal plasmider og exosomes^10,11,12,13. Viral-baserte metoder inkluderer ikke-integrere virus, slik som Adenovirus, Sendai virus og proteiner, og integrere virus som retrovirus og lentivirus^10,11,12,13.

Ifølge flere studier, ingen vesentlige forskjeller har blitt lagt merke til blant disse metodene i forhold til effektiviteten av celle omprogrammering, derav valget av egnet metode strengt avhenger av celletypen som brukes og på påfølgende anvendelser av iPSCs oppnådd^14,15. Alle de nevnte metodene viser ulemper, for eksempel Sendai viruset er effektivt på alle celletyper, men krever mye passasjer for å få iPSCs; omprogrammering av episomes er utmerket for blodlegemer, men trenger modifisering av standard kultur forhold for fibroblaster; den PiggyBac metoden kan representere et attraktivt alternativ, men studier i menneskelige celler er fortsatt begrenset og svak^10,11,12,13. Exosomes er nano-blemmer fysiologisk utskilles i alle kroppsvæsker av celler. Ifølge nyere studier, er de ansvarlige for intercellulære kommunikasjon og kan ha en rolle i viktige biologiske prosesser, for eksempel celle spredning, migrasjon og differensiering. Exosomes kan transportere og overføre mRNA og miRNA til mottaker celler med en helt naturlig mekanisme, som de deler den samme sammensetningen av cellemembranen¹⁶. Derfor er exosomes en lovende ny generasjon teknikk for omprogrammering, men deres potensial til å programmere somatiske celler av innholdet deres er fortsatt under etterforskning. Viral vektorer-baserte metoder bruker virus endret for å formidle omprogrammering gener til mottaker celler. Denne teknikken, til tross for den høye effektiviteten av omprogrammering, er ikke betraktet som sikker, som integrering av viruset i cellen kan være ansvarlig for smitte, teratomer og genomisk ustabilitet¹⁷.

Følgende protokoll for å generere iPSCs kolonier kombinerer Yamanaka ‘ s og Thompson ‘ s omprogrammering cocktail og er basert på bruk av en metode som krever NM-RNAs og immune Evasion faktorer med mulighet til å utføre den i Xeno-frie forhold. Begrunnelsen for bruken av denne metoden er å spre, innenfor det vitenskapelige samfunnet, en protokoll som tillater en rask, enkel og svært effektiv omprogrammering av voksne menneskelige fibroblaster fra abdominal hud til iPSCs¹⁸.

Styrkene til den foreslåtte metoden er faktisk den enkle ytelsen og den korte tiden som trengs for å få iPSCs. Videre metoden unngår cellulære forsvar mekanismer og bruk av viral vektorer, ansvarlig for relevante problemstillinger.

Når det gjelder standardprotokollen, ble følgende endringer gjort: (1) Confluent fibroblaster ble synkronisert ved passering 4 ved å plassere i 0,1% serum for 48 h før trypsinization; (2) Cellular tetthet for kultur og volumet av reagenser ble justert for utnyttelse på en 24-brønn multi-brønn plate i stedet for en 6-brønn plate; (3) omprogrammering eksperimentet ble utført ved hjelp av en 5% CO₂ inkubator i stedet for en inkubator med atmosfærisk (21% o₂) eller hypoxic (5% o₂) forhold.

Protocol

Prøvene fra menneske vevet ble samlet inn i henhold til Declaration of Helsinki mens de observerte retningslinjene for Universitetssykehuset Federico II. Alle pasienter som er involvert i denne studien, leverte skriftlig samtykke. 1. utarbeidelse av rekvisita og kultur Media Rengjør og autoklav ett stort par kirurgisk saks, to sett med fin tang, to par microdissecting saks, 1 L steril flaske, 500 mL steril flaske, og en 250 mL steril flaske. Klargjør 100 mm plater, 60 mm…

Representative Results

Målet med protokollen var å programmere dermal fibroblaster isolert fra abdominal hud ved hjelp av ikke-integrering omprogrammering metode basert på NM-RNAs for å indusere uttrykk for spesifikke faktorer. For å oppnå dette målet, menneskelige dermal fibroblaster ble isolert fra huden eksemplarer av pasienter som gjennomgår mageplastikk kirurgi og iPSCs ble generert innføre Oct4, Sox2, Klf4, cMyc, Nanog, Lin28 omprogrammering faktorer og E3, K3, B18 immune Evasion faktorer av en kommersiell klar til bruk omprogra…

Discussion

iPSCs er raskt fremstår som den mest lovende celle kandidat for regenererende medisin applikasjoner og som et enormt nyttig verktøy for sykdoms modellering og narkotika testing^3,8. Protokollen som presenteres her beskriver generering av menneskelige iPSCs fra en prøve å ha på størrelse med en hud punch biopsi med en enkel og effektiv prosedyre som ikke krever noe spesifikt utstyr eller tidligere erfaring med omprogrammering teknologi.

<p class="jove_con…

Materials

10 mL serological pipet	Falcon	357551	Sterile, polystyrene
100 mm plates	Falcon	351029	Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes	Falcon	352097	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
24-well plates	Falcon	353935	Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile
25 mL serological pipet	Falcon	357525	Sterile, polystyrene
35 mm plates	Falcon	353001	Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipet	Falcon	357543	Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubes	Falcon	352098	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Gibco	12491-015	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Sigma- Aldrich	D6429-500ml	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine Serum	Sigma- Aldrich	F9665-500ml	Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma- Aldrich	H1387-1L	Powder
L-glutamine	Lonza	BE17-605E	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	INVITROGEN	13778-030	Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 °C
Matrigel	CORNING	354234	Basement Membrane Matrix, store at -20 °C. Avoid multiple freeze-thaws.
Neubauer Chamber	VWR	631-1116	Hemocytometer
NutriStem XF Culture Medium	Biological Industries	05-100-1A-500ml	Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 °C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 °C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles.
Opti-MEM	Gibco	31985-062-100ml	Reduced-Serum Medium; store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Penicillin and Streptomycin	Sigma- Aldrich	P4333-100ml	Store at -20 °C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Potassium Chloride	Sigma- Aldrich	P9333	Powder
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma- Aldrich	P5665	Powder
RNase-free 0.5 mL tubes	Eppendorf	H0030124537	RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNase-free 1.5 mL tubes	Eppendorf	H0030120086	RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNaseZAP	INVITROGEN	AM9780	Cleaning agent for removing RNase
Sodium Bicarbonate	Sigma- Aldrich	S5761	Powder
Sodium Chloride	Sigma- Aldrich	S7653	Powder
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma- Aldrich	94046	Powder
StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit	Reprocell	00-0076	Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 °C.
Trypsin-EDTA	Sigma- Aldrich	T4049-100ml	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles