구조적 DNA 변경 분석 및 환자 유래 제노이식을 사용하여 암에 있는 표적으로 한 치료 시험
Summary
여기서 우리는 종양의 게놈 메이크업에 기초하여 선택된 표적 치료의 효능을 시험하기 위한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 구조적인 DNA 재배열의 확인 그리고 검증, 마우스로 환자의 종양의 이식 및 해당 약에 대한 반응을 시험하는 것을 기술합니다.
Abstract
당사는 환자 유래 제노이식(PDX)을 사용하여 차세대 시퀀싱 테크놀로 기, 치료 표적 분석 및 약물 반응 모니터링을 결합한 표적 치료법의 효능을 테스트하기 위한 통합 접근법을 소개합니다. 이 전략은 예로 난소 종양을 사용하여 검증되었습니다. 메이트 쌍 차세대 시퀀싱(MpPseq) 프로토콜은 구조적 변화를 식별하는 데 사용되었으며, 그 다음에는 잠재적으로 표적화 가능한 변경에 대한 분석이 뒤따랐습니다. 면역 절제된 마우스에서 자란 인간 종양은 게놈 분석에 기초하여 선택된 약물로 처리되었다. 결과는 PDX 모델에서 예측된 응답과 관찰된 응답 사이의 좋은 상관 관계를 보여 주었다. 제시된 접근은 조합 처리의 효험을 시험하고 재발성 암을 가진 환자를 위한 개인화한 처리를 돕기 위하여 이용될 수 있습니다, 표준 치료가 실패하고 라벨 떨어져 약을 사용할 필요가 있는 경우에 특히.
Introduction
환자 종양 조각을 면역형 마우스로 이식하여 발생하는 환자 유래 이종이이식(PDXs)은 개인화된 항암 치료를 돕기 위한 강력한 전임상 모델로 부상하고 있다. PDX 모델은 다양한 인간 악성 을 위해 성공적으로 개발되었습니다. 여기에는 유방 및 난소암, 악성 흑색종, 대장암, 췌장 선암 및 비소세포 폐암1,,2,,3,,4,5가5포함됩니다. 종양 조직은 정형소 또는 이종학적으로 이식될 수 있다. 전자, 더 정확 하지만 기술적으로 어려운 간주, 종양 기원의 기관에 직접 이식 을 포함. 이러한 유형의 모델은 종양6,,7에대한 “자연적인’ 미세 환경으로 인해 원래 종양의 조직학을 정확하게 모방하는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 마우스 난소의 부르사내로의 교정 이식은 종양이 복막 구멍으로 보급되고, 난소암8의전형적인 아분담의 생산으로 종양이 보급되었다. 유사하게, 복부 유방 선 대신 흉부로 유방 종양의 주입은 PDX 성공률 및 행동9에영향을 미쳤다. 그러나, 치열 교정 모형은 종양 성장을 감시하기 위하여 정교한 화상 진찰 시스템을 요구합니다. 고형 종양의 이종화 이식은 전형적으로 종양 성장을 쉽게 모니터링할 수 있고 비용이 적게소요되는7인 마우스의 피하 측면에 조직을 이식하여 수행됩니다. 그러나, 종양은 기립성이식(10)의경우와 달리 피하로 성장했다.
이식성공률은 종양 유형에 따라 다양하고 크게 의존하는 것으로 나타났다. 종양 세포의 더 높은 백분율을 포함하는 더 공격적인 종양 및 조직 견본은 더 나은 성공률12,,13가있기 위하여 보고되었습니다. 이와 일치, 전이성 부위에서 파생된 종양은 50-80%의 주파수에서 이식하는 것으로 나타났으며, 1차 부위에서 온 종양은 14%12로낮은 주파수에서 이식하는 것으로 나타났다. 대조적으로, 괴사 세포를 포함하는 조직 및 더 적은 실행 가능한 종양 세포가 제대로 이식합니다. 종양 성장은 또한 원래 종양의 특성을 손상시키지 않고마우스(14)로 주입될 때 조직 혼합에 지하 막 매트릭스 단백질을 첨가함으로써 촉진될 수 있다. 이식을 위한 조직 조각의 크기와 수는 또한 이식의 성공률에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 더 큰 종양 테이크 비율은 원래 종양 기질을 유지하고 숙주 기질 세포를 제공하기 위해 서브 신장 캡슐의 능력에 의한 피하 이식에 비해 하위 신장 캡슐에서 이식을 위해 보고되었다15.
대부분의 연구는 NOD/SCID 면역 결핍 마우스를 사용, 이는 자연 킬러 세포 부족16 다른 균주에 비해 종양 engraftment, 성장 및 전이를 증가 표시 되었습니다14. 그러나,13세의3-4개월 초에 흉림프종을 개발할 수 있기 때문에 추가 모니터링이 필요하다. SCID 마우스에서 자란 난소 종양 이식에서, B 세포의 아웃성장은 림프종의 발달을 방지하지만 난소종양(17)의이식에 영향을 미치지 않고 리툭시맙에 의해 성공적으로 억제되었다.
최근에는 NSG(NOD) Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)마우스는 인터류신 2 수용체 감마사슬(18)을코딩하는 유전자에서 null 돌연변이를 운반하여 PDX 모델의 생성에 자주 사용되는 변형이 되었다. 마우스의 미래 세대로 항통과된 PDX 모델으로부터종양은 3~6세대19,,20대에대한 조직학적 및 분자 특성을 유지하는 것으로 보고된다. 수많은 연구는 PDX 모델에서 처리 결과가 그들의 해당 환자의 그(것)들을 모방한다는 것을 보여주었습니다2,,33,4,,21,,22,,23. 비소폐암 및 대장암에 대한 PDX 모델에서 화학요법에 대한 반응률은 동일한약물(24,,25)에대한 임상 시험과 유사했다. 임상시험에 등록된 환자를 위해 개발된 PDX 모델에서 실시한 연구는 해당 환자에서 임상적으로 관찰된 약물과 유사한 테스트된 약물에 대한 반응을입증했다 2,,3,,4.
PDX 모델과 함께 환자 종양의 높은 처리량 게놈 분석은 특정 게놈 변경과 치료 반응 사이의 상관 관계를 연구하는 강력한 도구를 제공합니다. 이들은 몇 가지 간행물26,,27에설명되었습니다. 예를 들어, EGFR 증폭을 운반하는 대장 PDX 모델 세트에서 EGFR 억제제 cetuximab에 대한 치료 반응은환자(28)에서cetuximab에 대한 병렬 임상 반응이다.
PDX 모델의 개발 및 적용과 관련된 몇 가지 과제가 있습니다. 그 중 종양 이질성(29)은29PDX30 내의 증식 능력이 높은 단일 세포 클론으로서 처리 반응 해석의 정확도를 손상시킬 수 있어 다른세포(31)를능가할 수 있으므로 이질성의 손실을 초래한다. 추가적으로, 단 하나 종양 생검이 PDX를 개발하기 위하여 이용될 때, 세포 인구의 몇몇은 놓칠 수 있고 최종 이식에서 표현되지 않을 것입니다. 동일한 종양에서 여러 샘플이 문제를 해결하기 위해 이식하는 것이 좋습니다. PDX 종양은 원래 기증자 종양의 모든 세포 유형을 포함하는 경향이 있지만, 이러한 세포는 점차적으로 뮤린 기원3의사람들에 의해 대체된다. PDX 모형에 있는 뮤린 스트로마와 인간 종양 세포 사이 상호 작용은 잘 이해되지 않습니다. 그럼에도 불구하고, 기질 세포는 종양미세환경(33)을재구성하는 것으로 나타났다.
이러한 제한에도 불구하고 PDX 모델은 환자 치료를 선택하기 위한 맞춤형 의학뿐만 아니라 번역 연구를위한 가장 가치있는 도구 중 하나입니다. PDX의 주요 응용 프로그램은 바이오 마커 발견 및 약물 테스트를 포함한다. PDX 모델은 또한 성공적으로 약물 내성 메커니즘을 연구하고 약물 저항을 극복하기위한 전략을 식별하는 데사용된다 34,,35. 본 원고에 기재된 접근법은 연구원이 인간 종양에 있는 잠재적인 치료 표적을 확인하고 생체내에서 대응하는 약의 효험을 평가하는 것을허용합니다, 처음에 genomically 특징이 었던 이식된 종양을 품고 있는 마우스에서. 프로토콜은 인과간 이식된 난소 종양을 사용하지만 마우스2,,3,,12에서성장하기에 충분히 공격적인 종양의 모든 유형에 적용가능하다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 우리가 시험을 위한 약의 최상 선택을 결정하기 위하여 게놈 프로파일링에 의해 얻어진 종양의 분자 특성을 이용하는 PDX 모형에 있는 “임상 시험”을 수행하는 데 이용된 접근 및 프로토콜을 기술합니다. 다중 시퀀싱 플랫폼은 현재 전체 게놈 시퀀싱, RNAEq 및 사용자 정의 유전자 패널을 포함한 1 차 종양의 게놈 특성화에 사용됩니다. 고급 난소 암종의 경우, 구조적 변경, DNA 재배열 및 복사 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 실험을 수행하는 데 도움을 준 린 양 박사와 페이 R. 해리스 박사를 위한 메이요 클리닉 센터 (CIM) 박사에게 감사드립니다. 이 작품은 개인화 의학 (CIM)에 대한 메이요 클리닉 센터에 씨와 부인 닐 E. 에클스의 선물에 의해 지원되었다.
Materials
| 3M Vetbond | 3M, Co. | 1469SB | |
| anti-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9272 | |
| Anti-GAPDH antibody(G-9) | Santa Cruz Biotech. Inc. | sc-365062 | |
| Anti-MAPK antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9926 | |
| Anti-phospho-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9271 | |
| Anti-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2972 | |
| Anti-Phospho-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2971 | |
| Anti-Phospho-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 4858 | |
| Anti-Rictor antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2114 | |
| Anti-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2217 | |
| Captisol | ChemScene, Inc. | cs-0731 | |
| Carboplatin | NOVAPLUS, Inc. | 61703-360-18 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Easy-A Hi-Fi PCR Cloning Enzyme | Agilent, Inc. | 600404-51 | |
| Lubricant | Cardinal Healthcare | 82-280 | |
| Matrigel | Corning, Inc. | 356234 | |
| McCoy's media | Mediatech, Inc. | 10-050-CV | |
| MK-2206 | ApexBio, Inc. | A3010 | |
| MK-8669 | ARIAD Pharmaceuticals, Inc. | AP23573 | |
| Nair Sensitive Skin | Church & Dwight Co. | Nair Hair Remover Shower Power Sensitive | |
| NOD/SCID mice | Charles River, Inc. | NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl | |
| Paclitaxel | NOVAPLUS, Inc. | 55390-304-05 | |
| PEG400 | Millipore Sigma, Inc. | 88440-250ML-F | |
| Perjeta | Genetech, Co. | Pertuzumab | |
| Rituximab | Genetech, Co. | Rituxan | |
| RPMI1640 | Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| SCID mice | Harlan Laboratories, Inc. | C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg | |
| SLAx 13-6MHz linear transducer | FUJIFILM SonoSite, Inc | HFL38xp | |
| SonoSite S-series Ultrasound machine | FUJIFILM SonoSite, Inc | SonoSite SII | |
| Tween 80 | Millipore Sigma, Inc. | P4780-100ML |
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