Test de thérapies ciblées dans le cancer à l’aide de l’analyse structurale de l’altération de l’ADN et des Xénogreffes dérivées du patient
Summary
Ici, nous présentons un protocole pour tester l’efficacité des thérapies ciblées sélectionnées basées sur la composition génomique d’une tumeur. Le protocole décrit l’identification et la validation des réarrangements structurels d’ADN, l’engraftment des tumeurs des patients dans les souris et les réponses d’essai aux drogues correspondantes.
Abstract
Nous présentons ici une approche intégrative pour tester l’efficacité des thérapies ciblées qui combine la prochaine génération de séquençage technolo-gies, des analyses thérapeutiques de cible et la surveillance de la réponse médicamenteuse à l’aide de xénogreffes dérivées par le patient (PDX). Cette stratégie a été validée en utilisant des tumeurs ovariennes comme exemple. Le protocole de séquençage de la prochaine génération (MPseq) de la paire de partenaires a été utilisé pour identifier les altérations structurelles et suivi d’une analyse des altérations potentiellement ciblées. Les tumeurs humaines cultivées chez des souris immunocompromisées ont été traitées avec des médicaments sélectionnés sur la base des analyses génomiques. Les résultats ont démontré une bonne corrélation entre les réponses prévues et les réponses observées dans le modèle PDX. L’approche présentée peut être utilisée pour tester l’efficacité des traitements combinés et faciliter le traitement personnalisé pour les patients atteints d’un cancer récurrent, en particulier dans les cas où la thérapie standard échoue et il est nécessaire d’utiliser des médicaments hors étiquette.
Introduction
Les xénogreffes dérivées par le patient (PDX), qui sont générées par l’implantation de morceaux de tumeur de patient dans des souris immunodéficientes, ont émergé comme modèle préclinique puissant pour aider les soins anticancéreux personnalisés. Les modèles de PDX ont été développés avec succès pour une variété de malignités humaines. Il s’agit notamment des cancers du sein et de l’ovaire, du mélanome malin, du cancer colorectal, de l’adénocarcinome pancréatique et du cancer du poumon non à petites cellules1,,2,3,,4,5. Le tissu tumoral peut être implanté orthotopiquement ou hétérotopiquement. Le premier, considéré comme plus précis mais techniquement difficile, implique la transplantation directement dans l’organe d’origine tumorale. Ces types de modèles sont censés imiter précisément l’histologie de la tumeur d’origine en raison de la microenvironnement « ature » pour la tumeur6,7. Par exemple, la transplantation orthotopique dans la bourse de l’ovaire de souris a eu comme conséquence la diffusion de tumeur dans la cavité péritonéale et la production d’ascites, typique du cancer ovarien8. De même, l’injection de tumeurs mammaires dans le thoracique au lieu de la glande mammaire abdominale a affecté le taux de succès pdx et le comportement9. Cependant, les modèles orthotopiques nécessitent des systèmes d’imagerie sophistiqués pour surveiller la croissance tumorale. L’implantation hétérotopique de la tumeur solide est généralement effectuée en implantant le tissu dans le flanc sous-cutané d’une souris qui permet une surveillance plus facile de la croissance tumorale et est moins coûteux et chronophage7. Cependant, les tumeurs se sont développées sous-cutanéement rarement métastaser contrairement à ce qu’on observe dans le cas de l’implantation orthotopique10.
Le taux de réussite de l’engraftment a été montré pour varier et dépendent considérablement du type de tumeur. Des tumeurs plus agressives et des spécimens de tissus contenant un pourcentage plus élevé de cellules tumorales ont été signalés pour avoir de meilleurs taux de succès12,13. Compatible avec cela, les tumeurs dérivées de sites métastatiques ont été montrés à l’engraft à des fréquences de 50-80%, tandis que ceux des sites primaires engraft à des fréquences aussi basses que 14%12. En revanche, le tissu contenant des cellules nécrotiques et moins de cellules tumorales viables engraft mal. La croissance tumorale peut également être favorisée par l’ajout de protéines de matrice de membrane de sous-sol dans le mélange de tissu au moment de l’injection dans les souris14 sans compromettre les propriétés de la tumeur originale. La taille et le nombre de morceaux de tissu destinés à l’implantation se sont également avérés pour affecter le taux de succès de l’engraftment. Des taux de prise de tumeur plus élevés ont été rapportés pour l’implantation dans la capsule sub-rénale comparée à l’implantation sous-cutanée due à la capacité de la capsule sub-rénale de maintenir le stroma de tumeur original et de fournir les cellules stromales d’hôte aussi bien15.
La plupart des études utilisent des souris immunodéficientes NOD/SCID, qui manquent de cellules tueuses naturelles16 et ont été montrés pour augmenter l’engreftment de tumeur, la croissance et la métastase par rapport à d’autres souches14. Cependant, une surveillance supplémentaire est nécessaire car ils peuvent développer des lymphomes thymiques dès 3-4 mois del’âge 13. Dans les greffes de tumeur ovarienne cultivées chez les souris SCID, l’excroissance des cellules B a été avec succès inhibée par le rituximab, empêchant le développement des lymphomes mais sans impact sur l’engreffement des tumeurs ovariennes17.
Plus récemment, NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) souris, portant une mutation nulle dans le gène codant la chaîne gamma récepteur interleukine 218, est devenu une souche fréquemment utilisée pour la génération de modèles PDX. Les tumeurs des modèles PDX établis passés aux générations futures de souris sont rapportées pour maintenir des propriétés histologiques et moléculaires pour 3 à 6 générations19,20. De nombreuses études ont montré que les résultats du traitement dans les modèles PDX imitent ceux de leurs patients correspondants2,3,4,21,22,23. Le taux de réponse à la chimiothérapie dans les modèles PDX pour le cancer du poumon non-petit et les carcinomes colorectal était similaire à celui des essais cliniques pour les mêmes médicaments24,25. Des études menées dans des modèles PDX, développés pour les patients inscrits dans des essais cliniques, ont démontré des réponses à des médicaments testés similaires à ceux observés cliniquement chez les patientscorrespondants 2,3,4.
Les analyses génomiques à haut débit d’une tumeur patiente en conjonction avec des modèles PDX fournissent un outil puissant pour étudier les corrélations entre des altérations génomiques spécifiques et une réponse thérapeutique. Ceux-ci ont été décrits dans quelques publications26,27. Par exemple, les réponses thérapeutiques à l’inhibiteur egfr cétuximab dans un ensemble de modèles de PDX colorectal portant l’amplification EGFR, les réponses cliniques parallèles au cétuximab dans les patients28.
Il y a quelques défis associés au développement et à l’application des modèles PDX. Parmi ceux-ci est l’hétérogénéité de tumeur29,30 qui peut compromettre l’exactitude de l’interprétation de réponse de traitement comme un clone de cellule simple avec une capacité proliférative plus élevée dans un PDX peut dépasser les autres31, ayant ainsi pour résultat une perte d’hétérogénéité. En outre, lorsque des biopsies de tumeur simple sont employées pour développer PDX, certaines des populations de cellules peuvent être manquées et ne seront pas représentées dans la greffe finale. Plusieurs échantillons de la même tumeur sont recommandés pour l’implantation pour résoudre ce problème. Bien que les tumeurs PDX tendent à contenir tous les types cellulaires de la tumeur originale du donneur, ces cellules sont progressivement substituées par ceux d’origine murine3. L’interaction entre le stroma murine et les cellules tumorales humaines dans les modèles PDX n’est pas bien comprise. Néanmoins, les cellules stromales ont été montrées pour récapituler le microenvironnement de tumeur33.
Malgré ces limitations, les modèles PDX demeurent parmi les outils les plus précieux pour la recherche translationnelle ainsi que la médecine personnalisée pour la sélection des thérapies pour les patients. Les principales applications des PDX comprennent la découverte de biomarqueurs et le dépistage des drogues. Les modèles PDX sont également utilisés avec succès pour étudier les mécanismes de résistance aux médicaments et identifier des stratégies pour surmonter la résistance aux médicaments34,35. L’approche décrite dans le présent manuscrit permet au chercheur d’identifier des cibles thérapeutiques potentielles dans les tumeurs humaines et d’évaluer l’efficacité des médicaments correspondants in vivo, chez les souris hébergeant des tumeurs engraftées qui ont été initialement caractérisées par la génomique. Le protocole utilise des tumeurs ovariennes engraftées intrapéritoneally mais s’applique à n’importe quel type de tumeur suffisamment agressive pour se développer chez les souris2,3,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons l’approche et les protocoles que nous avons utilisés pour mener un « essai clinique » dans des modèles PDX qui tirent parti des caractéristiques moléculaires de la tumeur obtenues par le profilage génomique pour déterminer le meilleur choix de médicaments pour le test. Plusieurs plates-formes de séquençage sont actuellement utilisées pour la caractérisation génomique des tumeurs primaires, y compris le séquençage du génome entier, RNAseq et des panneaux génétiques personnalisés. Pour…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les membres du Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM) Dr Lin Yang et Faye R. Harris, MS, pour leur aide dans la conduite d’expériences. Ce travail a été appuyé par le don de M. et Mme Neil E. Eckles au Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM).
Materials
| 3M Vetbond | 3M, Co. | 1469SB | |
| anti-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9272 | |
| Anti-GAPDH antibody(G-9) | Santa Cruz Biotech. Inc. | sc-365062 | |
| Anti-MAPK antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9926 | |
| Anti-phospho-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9271 | |
| Anti-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2972 | |
| Anti-Phospho-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2971 | |
| Anti-Phospho-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 4858 | |
| Anti-Rictor antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2114 | |
| Anti-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2217 | |
| Captisol | ChemScene, Inc. | cs-0731 | |
| Carboplatin | NOVAPLUS, Inc. | 61703-360-18 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Easy-A Hi-Fi PCR Cloning Enzyme | Agilent, Inc. | 600404-51 | |
| Lubricant | Cardinal Healthcare | 82-280 | |
| Matrigel | Corning, Inc. | 356234 | |
| McCoy's media | Mediatech, Inc. | 10-050-CV | |
| MK-2206 | ApexBio, Inc. | A3010 | |
| MK-8669 | ARIAD Pharmaceuticals, Inc. | AP23573 | |
| Nair Sensitive Skin | Church & Dwight Co. | Nair Hair Remover Shower Power Sensitive | |
| NOD/SCID mice | Charles River, Inc. | NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl | |
| Paclitaxel | NOVAPLUS, Inc. | 55390-304-05 | |
| PEG400 | Millipore Sigma, Inc. | 88440-250ML-F | |
| Perjeta | Genetech, Co. | Pertuzumab | |
| Rituximab | Genetech, Co. | Rituxan | |
| RPMI1640 | Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| SCID mice | Harlan Laboratories, Inc. | C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg | |
| SLAx 13-6MHz linear transducer | FUJIFILM SonoSite, Inc | HFL38xp | |
| SonoSite S-series Ultrasound machine | FUJIFILM SonoSite, Inc | SonoSite SII | |
| Tween 80 | Millipore Sigma, Inc. | P4780-100ML |
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