Testando terapias-alvo em câncer usando análise estrutural de alteração de DNA e xenoenxertos derivados do paciente
Summary
Aqui apresentamos um protocolo para testar a eficácia de terapias-alvo selecionadas com base na composição genômica de um tumor. O protocolo descreve a identificação e validação de rearranjos estruturais de DNA, o enxerto dos tumores dos pacientes em camundongos e as respostas de teste a medicamentos correspondentes.
Abstract
Apresentamos aqui uma abordagem integrativa para testar a eficácia de terapias-alvo que combina a próxima geração de sequenciamento technolo-gies, análises de alvos terapêuticos e monitoramento de resposta a medicamentos usando xenoenxertos derivados do paciente (PDX). Essa estratégia foi validada usando tumores ovarianos como exemplo. O protocolo de sequenciamento de próxima geração (MPseq) foi utilizado para identificar alterações estruturais e seguido pela análise de alterações potencialmente direcionadas. Tumores humanos cultivados em camundongos imunocomprometidos foram tratados com drogas selecionadas com base nas análises genômicas. Os resultados demonstraram uma boa correlação entre as respostas previstas e as observadas no modelo PDX. A abordagem apresentada pode ser utilizada para testar a eficácia de tratamentos combinados e auxiliar o tratamento personalizado para pacientes com câncer recorrente, especificamente nos casos em que a terapia padrão falha e há a necessidade de usar medicamentos fora do rótulo.
Introduction
Os xenoenxertos derivados do paciente (PDXs), gerados a partir da implantação de pedaços de tumores de pacientes em camundongos imunodeficientes, emergiram como um poderoso modelo pré-clínico para ajudar o cuidado anticâncológico personalizado. Modelos PDX foram desenvolvidos com sucesso para uma variedade de malignidades humanas. Estes incluem câncer de mama e ovário, melanoma maligno, câncer colorretal, adenocarcinoma pancreático e câncer de pulmão de células não pequenas1,,2,3,,4,5. O tecido tumoral pode ser implantado ortotopicamente ou heterototopicamente. O primeiro, considerado mais preciso, mas tecnicamente difícil, envolve transplante diretamente no órgão de origem tumoral. Acredita-se que esses tipos de modelos imitam precisamente a histologia do tumor original devido ao microambiente “natural” para o tumor6,,7. Por exemplo, o transplante ortotópico na bursa do ovário do camundongo resultou na disseminação do tumor na cavidade peritoneal e na produção de ascites, típicas do câncer de ovário8. Da mesma forma, a injeção de tumores mamários no torácico em vez da glândula mamária abdominal afetou a taxa de sucesso do PDX e o comportamento9. No entanto, modelos ortotópicos requerem sistemas de imagem sofisticados para monitorar o crescimento do tumor. A implantação heterotópica do tumor sólido é tipicamente realizada implantando tecido no flanco subcutâneo de um camundongo que permite um monitoramento mais fácil do crescimento do tumor e é menos caro e demorado7. No entanto, os tumores cultivados subcutânea raramente metástases ao contrário do observado no caso da implantação ortotópica10.
A taxa de sucesso do enxerto tem sido demonstrada para variar e depende muito do tipo de tumor. Tumores mais agressivos e amostras de tecidos contendo um maior percentual de células tumorais foram relatados com melhores taxas de sucesso12,13. Consistente com isso, tumores derivados de sítios metastáticos mostraram-se engrafados em frequências de 50 a 80%, enquanto os de locais primários engrafam em frequências tão baixas quanto 14%12. Em contraste, tecidos contendo células necrosas e menos células tumorais viáveis se inerverem mal. O crescimento tumoral também pode ser promovido pela adição de proteínas da matriz de membrana do porão na mistura tecidual no momento da injeção em camundongos14 sem comprometer as propriedades do tumor original. O tamanho e o número de peças de tecido destinadas à implantação também foram encontrados para afetar a taxa de sucesso do enxerto. Maiores taxas de acolhimento de tumores foram relatadas para implantação na cápsula sub-renal em comparação com a implantação subcutânea devido à capacidade da cápsula sub-renal de manter o estroma tumoral original e fornecer as células estromais hospedeiras, bem como15.
A maioria dos estudos usa camundongos imunodeficientes NOD/SCID, que não possuem células assassinas naturais16 e têm sido mostrados para aumentar o enenxerto tumoral, crescimento e metástase em comparação com outras cepas14. No entanto, é necessário um monitoramento adicional, pois eles podem desenvolver linfomas tímicos entre 3 e 4 meses de idadeaos 13 anos. Em transplantes de tumores ovarianos cultivados em camundongos SCID, o crescimento das células B foi inibido com sucesso pelo rituximabe, impedindo o desenvolvimento de linfomas, mas sem impactar o enxerto de tumores ovarianos17.
Mais recentemente, NSG (NOD. CamundongosCG-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, carregando uma mutação nula no gene que codifica a cadeia gama de receptores 2 interleucina2,tornou-se uma cepa frequentemente usada para a geração de modelos PDX. Tumores de modelos PDX estabelecidos passagens para as gerações futuras de camundongos são relatados para reter propriedades histológicas e moleculares por 3 a 6 gerações19,20. Inúmeros estudos têm demonstrado que os desfechos do tratamento em modelos PDX imitam os de seus pacientes correspondentes2,3,4,21,22,23. A taxa de resposta à quimioterapia em modelos PDX para câncer de pulmão não pequeno e carcinomas colorretais foi semelhante à dos ensaios clínicos para os mesmos fármacos24,25. Estudos realizados em modelos PDX, desenvolvidos para pacientes matriculados em ensaios clínicos, demonstraram respostas a medicamentos testados semelhantes aos observados clinicamente em pacientes correspondentes2,,3,4.
Análises genômicas de alto rendimento de um tumor paciente em conjunto com modelos PDX fornecem uma ferramenta poderosa para estudar correlações entre alterações genômicas específicas e uma resposta terapêutica. Estes foram descritos em algumas publicações26,27. Por exemplo, respostas terapêuticas ao inibidor de EGFR cetuximab em um conjunto de modelos PDX colorretal que carregam amplificação EGFR, respostas clínicas paralelas ao cetuximabe em pacientes28.
Existem alguns desafios associados ao desenvolvimento e aplicação de modelos PDX. Entre eles está a heterogeneidade tumoral29,30 que pode comprometer a precisão da interpretação da resposta ao tratamento como um único clone celular com maior capacidade proliferativa dentro de um PDX pode superar os outros31,resultando assim em uma perda de heterogeneidade. Além disso, quando biópsias de tumores individuais são usadas para desenvolver PDX, algumas das populações celulares podem ser perdidas e não serão representadas no enxerto final. Várias amostras do mesmo tumor são recomendadas para implantação para resolver este problema. Embora os tumores PDX tendem a conter todos os tipos celulares do tumor doador original, essas células são gradualmente substituídas pelas de origem murina3. A interação entre as células murinas e tumorais humanas em modelos PDX não é bem compreendida. No entanto, as células estromas foram mostradas para recapitular o microambiente tumoral33.
Apesar dessas limitações, os modelos PDX permanecem entre as ferramentas mais valiosas para pesquisa translacional, bem como medicamentos personalizados para a seleção de terapias de pacientes. As principais aplicações de PDXs incluem a descoberta de biomarcadores e testes de drogas. Os modelos PDX também são usados com sucesso para estudar mecanismos de resistência a medicamentos e identificar estratégias para superar a resistência a medicamentos34,35. A abordagem descrita no presente manuscrito permite ao pesquisador identificar potenciais alvos terapêuticos em tumores humanos e avaliar a eficácia de medicamentos correspondentes invivo, em camundongos que abrigam tumores engrafados que inicialmente foram caracterizados genomicamente. O protocolo usa tumores ovarianos engrafados intraperitoneally, mas é aplicável a qualquer tipo de tumor suficientemente agressivo para crescer em camundongos2,,3,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descrevemos a abordagem e os protocolos que usamos para realizar um “ensaio clínico” em modelos PDX que se aproveita das características moleculares do tumor obtidas pelo perfil genômico para determinar a melhor escolha de medicamentos para testes. Várias plataformas de sequenciamento são atualmente usadas para caracterização genômica de tumores primários, incluindo sequenciamento de genoma inteiro, RNAseq e painéis genéticos personalizados. Para carcinoma ovariano de alto grau, mPseq para identificar alteraç…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos aos membros do Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM) Dr. Lin Yang e Faye R. Harris, MS, pela ajuda na realização de experimentos. Este trabalho foi apoiado pelo Presente do Sr. e Sra. Neil E. Eckles para o Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM).
Materials
| 3M Vetbond | 3M, Co. | 1469SB | |
| anti-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9272 | |
| Anti-GAPDH antibody(G-9) | Santa Cruz Biotech. Inc. | sc-365062 | |
| Anti-MAPK antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9926 | |
| Anti-phospho-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9271 | |
| Anti-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2972 | |
| Anti-Phospho-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2971 | |
| Anti-Phospho-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 4858 | |
| Anti-Rictor antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2114 | |
| Anti-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2217 | |
| Captisol | ChemScene, Inc. | cs-0731 | |
| Carboplatin | NOVAPLUS, Inc. | 61703-360-18 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Easy-A Hi-Fi PCR Cloning Enzyme | Agilent, Inc. | 600404-51 | |
| Lubricant | Cardinal Healthcare | 82-280 | |
| Matrigel | Corning, Inc. | 356234 | |
| McCoy's media | Mediatech, Inc. | 10-050-CV | |
| MK-2206 | ApexBio, Inc. | A3010 | |
| MK-8669 | ARIAD Pharmaceuticals, Inc. | AP23573 | |
| Nair Sensitive Skin | Church & Dwight Co. | Nair Hair Remover Shower Power Sensitive | |
| NOD/SCID mice | Charles River, Inc. | NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl | |
| Paclitaxel | NOVAPLUS, Inc. | 55390-304-05 | |
| PEG400 | Millipore Sigma, Inc. | 88440-250ML-F | |
| Perjeta | Genetech, Co. | Pertuzumab | |
| Rituximab | Genetech, Co. | Rituxan | |
| RPMI1640 | Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| SCID mice | Harlan Laboratories, Inc. | C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg | |
| SLAx 13-6MHz linear transducer | FUJIFILM SonoSite, Inc | HFL38xp | |
| SonoSite S-series Ultrasound machine | FUJIFILM SonoSite, Inc | SonoSite SII | |
| Tween 80 | Millipore Sigma, Inc. | P4780-100ML |
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