Vi presenterer kylling korioallantoisk membran modell som et alternativ, transplanterbar, in vivo modell for engraftment av gynekologiske og urologiske kreft cellelinjer og pasient-avledede svulster.
Musemodeller er referansetestene for in vivo kreftstudier. Kostnader, tid og etiske hensyn har imidlertid ført til krav om alternative kreftmodeller. Kylling korioallantoisk membran (CAM) modellen gir et billig, raskt alternativ som tillater direkte visualisering av tumorutvikling og er egnet for in vivo imaging. Som sådan forsøkte vi å utvikle en optimalisert protokoll for å fengsle gynekologiske og urologiske svulster i denne modellen, som vi presenterer her. Omtrent 7 dager etterbefruktning flyttes luftcellen til den vaskualiserte siden av egget, hvor en åpning opprettes i skallet. Svulster fra murine og menneskelige cellelinjer og primærvev kan deretter bli transplantert. Disse er vanligvis seeded i en blanding av ekstracellulær matrise og medium for å unngå cellulær spredning og gi næringsstøtte til cellene rekrutterer en vaskulær forsyning. Svulster kan da vokse i opptil 14 dager før eggene klekkes. Ved å implantere celler som er stabilt transducert med firefly luciferase, kan bioluminescensavbildning brukes til sensitiv påvisning av tumorvekst på membranen og kreftcellen spredt over hele embryoet. Denne modellen kan potensielt brukes til å studere tumorigeniitet, invasjon, metastase og terapeutisk effektivitet. Kylling CAM-modellen krever betydelig mindre tid og økonomiske ressurser sammenlignet med tradisjonelle murine modeller. Fordi eggene er immunkompromitterte og immuntolerante, kan vev fra enhver organisme potensielt implanteres uten kostbare transgene dyr (f.eks. mus) som kreves for implantering av humant vev. Imidlertid kan mange av fordelene med denne modellen potensielt også være begrensninger, inkludert kort tumorgenerasjontid og immunkompromittert / immuntolerant status. I tillegg, selv om alle tumortyper presentert her engraft i kylling chorioallantoic membran modell, gjør de det med varierende grad av tumorvekst.
Mus har fungert som den klassiske modellorganismen for studiet av menneskelige sykdommer, inkludert malignitet. Som pattedyr deler de mange likheter med mennesker. Deres høye grad av genetisk likhet har tillatt transgen manipulering av musegenomet for å gi enorm innsikt i den genetiske kontrollen av menneskelige sykdommer1. Lang erfaring i håndteringen av og eksperimentering med mus har resultert i at de er modellen for valg for biomedisinsk forskning. Men i tillegg til de etiske og vitenskapelige bekymringene om murine modeller, kan de også være ganske kostbart og tidkrevende2,3. Utviklingen av svulster kan ta uker eller måneder. Boligen på en typisk institusjon alene kan kjøre i hundrevis til tusenvis av dollar mens svulster utvikler seg. Eggstokkreft er et eksempel på denne ulempen fordi veksten i murine modeller lett kan ta måneder. Forsinkelser i forskningsfremgang påvirker potensielt eggstokkreftpasienters vedvarende lave 5-årige overlevelsesrate på bare 47 % (dvs. en økning i overlevelse på bare 10 % over 30 år)4. Tilsvarende utgjør urologiske kreftformer (nyre-, prostata- og blærekreft) 19% av alle krefttilfeller i USA og 11% av kreftrelaterte dødsfall4. Dermed kan en ny in vivo tilnærming til å studere gynekologiske og urologiske kreftformer spare et laboratorium betydelig tid, arbeidskraft og penger, selv om denne modellen bare brukes til innledende screeningeksperimenter. I tillegg kan den resulterende akselerasjonen av forskningsfunn påvirke de 177.000 personene diagnostisert med disse kreftene årlig.
Kylling CAM modellen tilbyr mange fordeler som løser de nevnte problemene. En populær modell for å studere angiogenese5,6, tumorcelleinvasjon7,8, og metastase7,9, chick embryo CAM modellen har allerede blitt brukt til å studere mange former for kreft, inkludert glioma10,11,12, hode og nakke plateepitelkarsinom13,14, leukemi15,16, bukspyttkjertelkreft17, og kolorektal kreft18. I tillegg har CAM-modeller blitt generert for neuroblastom19, Burkitt lymfom20, melanom21og feline fibrosarcoma22. Tidligere studier har også presentert engraftment av blærekreft23 og prostatakreft cellelinjer24, men med begrensede protokolldetaljer. Ikke bare er egg mye billigere enn mus, men de produserer også svært reproduserbare resultater25,26. De viser rask vaskulaturutvikling, og tumorengraftment kan oppstå så raskt som noen få dager og visualiseres langsgående gjennom det åpne vinduet. Med 21 dagers tidsramme mellom eggbefruktning og klekking, kan eksperimenter fullføres i løpet av få uker. Videre tillater de lave kostnadene, begrensede boligbehov og små størrelse lett store eksperimenter som ville være uoverkommelige for musestudier.
Derfor forsøkte vi å optimalisere CAM-modellen for engraftment av gynekologiske og urologiske kreftformer. På grunn av den immunkompromitterte statusen til det tidlige kyllingembryoet27, kan både mus og menneskelige celler lett implanteres. Som sådan har vi med hell engrafted ovarie-, nyre-, prostata- og blærekreft. For hver av disse tumortypene aksepterer CAM lett etablerte murine- og/eller humane tumorcellelinjer. Viktigere, nyhøstet primære menneskelige tumorvev kan også engraft fra enten fordøyd celler eller biter av solid vev med høye priser på suksess. Hver av disse krefttyper og cellekilder krever optimalisering, som vi deler her.
Tumorutvidelse og engraftment ved hjelp av CAM-modellen tillater raskere og direkte observerbar tumorvekst enn eksisterende in vivo dyremodeller. I tillegg er kostnadene betydelig lavere når det første kjøpet av utstyr er fullført, spesielt sammenlignet med kostnadene for immunkompromitterte mus. Den første, immunkompromitterte tilstanden av kyllingembryoer tillater lett engraftment av humant og mininvev. Selv med disse styrkene har CAM-modellen begrensninger. Den korte tiden som kan være en fordel kan også være …
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Dr. Fuyuhiko Tamanoi og Binh Vu for den første treningen på denne metoden. Diskusjoner med Dr. Eva Koziolek har vært medvirkende til å optimalisere denne tilnærmingen og har blitt veldig verdsatt. Dette arbeidet ville ikke vært mulig uten finansiering fra følgende kilder: Tobakksrelatert sykdomsforskningsprogram Postdoktorfellesskap (27FT-0023, til ACS), Department of Defense (DoD) Ovarian Cancer Research Program (W81XWH-17-1-0160), NCI / NIH (1R21CA216770), Tobakksrelatert sykdom Research Program High Impact Pilot Award (27IR-0016), og UCLA institusjonell støtte, inkludert en JCCC Seed Grant (NCI/NIH P30CA016042) og et 3R Grant fra Office of the Vice Chancellor for Research til LW.
-010 Teflon (PTFE) White 55 Duro Shore D O-Rings | The O-Ring Store | TEF010 | Nonstick ring for cell seeding. 1/4"ID X 3/8"OD X 1/16"CS Polytetrafluoroethylene (PTFE). |
C4-2 | ATCC | CRL-3314 | Human prostate cancer cell line. |
CWR22Rv1 | CWR cells were the kind gift of Dr. David Agus (Keck Medicine of University of Southern California) | ||
Cytokeratin 8/18 Antibody (C-51) | Novus Biologicals | NBP2-44929-0.02mg | Used at a dilution of 1:100 for immunohistochemical analysis of human ovarian CAM tumors. |
D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
Delicate Operating Scissors; Curved; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4-3/4 in. Overall Length | Roboz Surgical | RS6703 | This is provided as an example. Any similar curved scissors would work as well. |
Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | This kit contains all necessary tools. |
Fertilized chicken eggs (Rhode Island Red – Brown, Lab Grade) | AA Lab Eggs Inc. | N/A | A local egg supplier would need to be identified, as this supplier only delivers regionally. |
HT-1376 | ATCC | CRL-1472 | Human bladder cancer cell line. |
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D-NONE-1102-1588-1357 | Other egg incubators may be used, but their reliability would need to be verified. After implantation, a cell incubator with the CO2 disabled may also be used. |
ID8 | Not commercially available, please see PMID: 10753190. | ||
Incu-Bright Cool Light Egg Candler | Incubator Warehouse | 1102 | Other candlers may be used; however, this is preferred among those that we have tested. This candler is included in the aforementioned incubator kit. |
Iris Forceps, 10cm, Curved, Serrated, 0.8mm tips | World Precision Instrument | 15915 | This is provided as an example. Any similar curved forceps would work as well. Multiple brands have been used for this method. |
Isoflurane | Clipper Distributing | 0010250 | |
IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
Matrigel Membrane Matrix HC; LDEV-Free | Corning | 354248 | Extracellular matrix solution |
MyC-CaP | ATCC | CRL-3255 | Murine prostate cancer cell line. |
Portable Pipet-Aid XP Pipette Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | Any similar pipet controller would be appropriate. |
PrecisionGlide Hypodermic Needles | BD | 305196 | This is provided as an example. Any 18G needle would work similarly. |
RENCA | ATCC | CRL-2947 | |
Semken Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | This is provided as an example. Any similar forceps or another style that suits researcher preference would be appropriate. |
SKOV3 | ATCC | HTB-77 | Human ovarian cancer cell line. |
Specimen forceps | Electron Microscopy Sciences | 72914 | This is provided as an example. The forceps used for pulling away the shell for bioluminescence imaging are approximately 12.8 cm long with 3 mm-wide tips. |
Sterile Cotton Balls | Fisherbrand | 22-456-885 | This is provided as an example. Any sterile cotton balls would suffice. |
Stirring Rods with Rubber Policeman; 5mm diameter, 6 in. length | United Scientific Supplies | GRPL06 | This is provided as an example. Any similar glass stir rods would work as well. |
T24 | ATCC | HTB-4 | Human bladder cancer cell line. |
Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 21272 | |
Tissue Culture Dishes, 10 cm diameter | Corning | 353803 | This is provided as an example. Any similar, sterile 10-cm dish may be used. Tissue culture treatment is not necessary. |
Tygon Clear Laboratory Tubing – 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | This is provided as an example. Any similarly sized tubing would work as well. |