استخدام غشاء Chorioallantoic الدجاج في نموذج Vivo لدراسة أمراض النساء وسرطان المسالك البولية
Summary
نقدم نموذج غشاء chorioallantoic الدجاج كبديل، قابل للزرع، في نموذج الجسم الحي لتطعيم خطوط خلايا سرطان النساء والمسالك البولية والأورام المشتقة من المريض.
Abstract
نماذج الماوس هي الاختبارات القياسية في دراسات السرطان في الجسم الحي. ومع ذلك، أدت التكلفة والوقت والاعتبارات الأخلاقية إلى دعوات لبديل في نماذج السرطان في الجسم الحي. يوفر نموذج غشاء الدجاج (CAM) بديلًا سريعًا وغير مكلف يسمح بالتصور المباشر لتطور الورم ومناسب للتصوير في الجسم الحي. على هذا النحو، سعينا لتطوير بروتوكول الأمثل لتطعيم الأورام النسائية والمسالك البولية في هذا النموذج، الذي نقدم هنا. ما يقرب من 7 أيام بعد الإخصاب ، يتم نقل خلية الهواء إلى الجانب الوعائي من البيض ، حيث يتم إنشاء فتحة في القشرة. ثم يمكن أن الأورام من المورين وخطوط الخلايا البشرية والأنسجة الأولية أن تتطعيم. وعادة ما تزرع هذه في خليط من مصفوفة خارج الخلية والمتوسطة لتجنب التشتت الخلوي وتوفير الدعم الغذائي حتى الخلايا تجنيد إمدادات الأوعية الدموية. قد تنمو الأورام بعد ذلك لمدة تصل إلى 14 يومًا إضافيًا قبل تفقيس البيض. من خلال زرع الخلايا المنقولة بشكل ثابت مع لوسيفيراز اليراعة ، يمكن استخدام التصوير الحيوي للكشف الحساس عن نمو الورم على الغشاء والخلايا السرطانية المنتشرة في جميع أنحاء الجنين. يمكن استخدام هذا النموذج لدراسة الورم والغزو والانبثاث والفعالية العلاجية. نموذج CAM الدجاج يتطلب وقتا أقل بكثير والموارد المالية بالمقارنة مع نماذج المورين التقليدية. نظرًا لأن البويضات لا تُحصى المناعة وتتسم بالمناعة، فمن المحتمل أن يتم زرع الأنسجة من أي كائن حي دون الحيوانات المعدلة وراثياً المكلفة (مثل الفئران) اللازمة لزرع الأنسجة البشرية. ومع ذلك، فإن العديد من مزايا هذا النموذج يمكن أن تكون أيضا القيود، بما في ذلك وقت توليد الورم القصير وحالة مناعة/مناعة متسامحة. بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن جميع أنواع الأورام المعروضة هنا في engraft نموذج غشاء chorioallantoic الدجاج، يفعلون ذلك مع درجات متفاوتة من نمو الورم.
Introduction
وقد عملت الفئران ككائن تقليدي نموذجي لدراسة الأمراض البشرية، بما في ذلك الأورام الخبيثة. كما الثدييات، فإنها تشترك في العديد من أوجه التشابه مع البشر. وقد سمحت درجة عالية من التشابه الجيني التلاعب المعدلة وراثيا من جينوم الماوس لتوفير نظرة هائلة في السيطرة الجينية للأمراض البشرية1. وقد أدت الخبرة الواسعة في التعامل مع الفئران وتجريبها في كونها النموذج المفضل للبحوث الطبية الحيوية. ومع ذلك ، بالإضافة إلى المخاوف الأخلاقية والعلمية بشأن نماذج المورين ، فإنها يمكن أن تكون مكلفة للغاية وتستغرق وقتًا طويلاً2،3. يمكن أن يستغرق تطور الأورام أسابيع أو حتى أشهر. السكن في مؤسسة نموذجية وحدها يمكن أن تعمل في مئات إلى آلاف الدولارات في حين أن الأورام تتطور. سرطان المبيض هو مثال على هذا العيب لأن نموه في نماذج مورين يمكن أن يستغرق أشهرا بسهولة. التأخير في التقدم البحثي يحتمل أن تؤثر على مرضى سرطان المبيض منخفضة باستمرار 5 سنوات معدل البقاء على قيد الحياة من 47٪ فقط (أي زيادة في البقاء على قيد الحياة فقط 10٪ على مدى 30 عاما)4. وبالمثل، تشكل سرطانات المسالك البولية (سرطانات الكلى والبروستاتا والمثانة) 19% من جميع حالات السرطان في الولايات المتحدة و11% من الوفيات المرتبطة بالسرطان4. وهكذا، فإن رواية في الجسم الحي لنهج لدراسة أمراض النساء وسرطان المسالك البولية يمكن أن توفر مختبر الكثير من الوقت، والعمل، والمال، حتى لو تم تطبيق هذا النموذج فقط على تجارب الفحص الأولي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤثر تسارع نتائج البحوث الناتج عن ذلك بشكل كبير على 177,000 شخص يتم تشخيصهم بهذه السرطانات سنويًا.
نموذج كام الدجاج يقدم العديد من المزايا التي تعالج القضايا المذكورة أعلاه. نموذج شعبي لدراسة تولد الأوعية5،6، غزو الخلايا السرطانية7،8، والانبثاث7،9، وقد تم بالفعل استخدام نموذج الفرخ الجنين CAM لدراسة العديد من أشكال السرطان ، بما في ذلك الورم الدبقي10،11،12، سرطان الخلايا الحرشفية الرأس والرقبة13،14، سرطان الدم15،16، سرطان البنكرياس17، و سرطان القولون والمستقيم18. بالإضافة إلى ذلك، تم إنشاء نماذج CAM للورم الأرومي العصبي19، سرطان الغدد الليمفاوية بيركيت20، سرطان الجلد21، والفيساركوما القطط22. وقد قدمت الدراسات السابقة أيضا تطعيم سرطان المثانة23 وخطوط خلايا سرطان البروستاتا24، ولكن مع تفاصيل بروتوكول محدودة. ليس فقط البيض أرخص بكثير من الفئران ، ولكنها تنتج أيضا نتائج قابلة للاستنساخ للغاية25،26. أنها تظهر تطور الأوعية الدموية السريع، ويمكن أن يحدث تطعيم الورم في أسرع بضعة أيام وتصور طوليا من خلال النافذة المفتوحة. مع الإطار الزمني 21 يوما بين تخصيب البويضة والفقس، يمكن الانتهاء من التجارب في غضون أسابيع قليلة. وعلاوة على ذلك، فإن انخفاض التكلفة، ومحدودية الاحتياجات السكنية، وصغر الحجم يسمحان بسهولة بإجراء تجارب واسعة النطاق من شأنها أن تكون مانعة لدراسات الفئران.
لذلك ، سعينا إلى تحسين نموذج CAM لتطعيم سرطانات أمراض النساء والمسالك البولية. نظرًا لحالة نقص المناعة لجنين الدجاج المبكر27، يمكن زرع كل من الخلايا الماوسية والبشرية بسهولة. على هذا النحو، نجحنا في تطعيم سرطانالمبيض والكلى والبروستاتا والمثانة. لكل من هذه الأنواع من الأورام, CAM يقبل بسهولة المورين المنشأة و / أو خطوط خلايا الورم البشري. الأهم من ذلك، يمكن أن الأنسجة الورم البشري الأولية حصادها حديثا أيضا إينجرافمنالمن الخلايا المهضمة أو قطع من الأنسجة الصلبة مع معدلات عالية من النجاح. كل من هذه الأنواع السرطان ومصادر الخلايا يتطلب التحسين، والتي نشارك هنا.
Protocol
Representative Results
Discussion
توسيع الورم وتطعيم باستخدام نموذج CAM يسمح نمو الورم أسرع ويمكن ملاحظته مباشرة من الموجودة في نماذج الحيوانات الحي. وبالإضافة إلى ذلك، فإن التكاليف تكون أقل بكثير بمجرد الانتهاء من الشراء الأولي للمعدات، لا سيما بالمقارنة مع تكلفة الفئران التي لا تنقصها المناعة. تسمح الحالة الأولية المنق?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفان أن يشكرا الدكتور فويوهيكو تامانوي وبينه فو على التدريب الأولي على هذه الطريقة. وكانت المناقشات مع الدكتورة إيفا كوزيوليك مفيدة في تحسين هذا النهج وحظيت بتقدير كبير. لم يكن هذا العمل ممكناً بدون تمويل من المصادر التالية: زمالة ما بعد الدكتوراه في برنامج أبحاث الأمراض المرتبطة بالتبغ (27FT-0023، إلى ACS)، وزارة الدفاع (وزارة الدفاع) برنامج أبحاث سرطان المبيض (W81XWH-17-1-0160)، NCI/NIH (1R21CA216770)، برنامج أبحاث الأمراض المرتبطة بالتبغ جائزة تجريبية عالية التأثير (27IR-0016)، والدعم المؤسسي في جامعة كاليفورنيا، بما في ذلك منحة بذور JCCC (NCI/NIH P30CA016042) ومنحة 3R من مكتب نائب المستشار للبحوث إلى LW.
Materials
| -010 Teflon (PTFE) White 55 Duro Shore D O-Rings | The O-Ring Store | TEF010 | Nonstick ring for cell seeding. 1/4"ID X 3/8"OD X 1/16"CS Polytetrafluoroethylene (PTFE). |
| C4-2 | ATCC | CRL-3314 | Human prostate cancer cell line. |
| CWR22Rv1 | CWR cells were the kind gift of Dr. David Agus (Keck Medicine of University of Southern California) | ||
| Cytokeratin 8/18 Antibody (C-51) | Novus Biologicals | NBP2-44929-0.02mg | Used at a dilution of 1:100 for immunohistochemical analysis of human ovarian CAM tumors. |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| Delicate Operating Scissors; Curved; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4-3/4 in. Overall Length | Roboz Surgical | RS6703 | This is provided as an example. Any similar curved scissors would work as well. |
| Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | This kit contains all necessary tools. |
| Fertilized chicken eggs (Rhode Island Red – Brown, Lab Grade) | AA Lab Eggs Inc. | N/A | A local egg supplier would need to be identified, as this supplier only delivers regionally. |
| HT-1376 | ATCC | CRL-1472 | Human bladder cancer cell line. |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D-NONE-1102-1588-1357 | Other egg incubators may be used, but their reliability would need to be verified. After implantation, a cell incubator with the CO2 disabled may also be used. |
| ID8 | Not commercially available, please see PMID: 10753190. | ||
| Incu-Bright Cool Light Egg Candler | Incubator Warehouse | 1102 | Other candlers may be used; however, this is preferred among those that we have tested. This candler is included in the aforementioned incubator kit. |
| Iris Forceps, 10cm, Curved, Serrated, 0.8mm tips | World Precision Instrument | 15915 | This is provided as an example. Any similar curved forceps would work as well. Multiple brands have been used for this method. |
| Isoflurane | Clipper Distributing | 0010250 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel Membrane Matrix HC; LDEV-Free | Corning | 354248 | Extracellular matrix solution |
| MyC-CaP | ATCC | CRL-3255 | Murine prostate cancer cell line. |
| Portable Pipet-Aid XP Pipette Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | Any similar pipet controller would be appropriate. |
| PrecisionGlide Hypodermic Needles | BD | 305196 | This is provided as an example. Any 18G needle would work similarly. |
| RENCA | ATCC | CRL-2947 | |
| Semken Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | This is provided as an example. Any similar forceps or another style that suits researcher preference would be appropriate. |
| SKOV3 | ATCC | HTB-77 | Human ovarian cancer cell line. |
| Specimen forceps | Electron Microscopy Sciences | 72914 | This is provided as an example. The forceps used for pulling away the shell for bioluminescence imaging are approximately 12.8 cm long with 3 mm-wide tips. |
| Sterile Cotton Balls | Fisherbrand | 22-456-885 | This is provided as an example. Any sterile cotton balls would suffice. |
| Stirring Rods with Rubber Policeman; 5mm diameter, 6 in. length | United Scientific Supplies | GRPL06 | This is provided as an example. Any similar glass stir rods would work as well. |
| T24 | ATCC | HTB-4 | Human bladder cancer cell line. |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 21272 | |
| Tissue Culture Dishes, 10 cm diameter | Corning | 353803 | This is provided as an example. Any similar, sterile 10-cm dish may be used. Tissue culture treatment is not necessary. |
| Tygon Clear Laboratory Tubing – 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | This is provided as an example. Any similarly sized tubing would work as well. |
Referências
- Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine. EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).
- Jackson, S. J., Thomas, G. J. Human tissue models in cancer research: looking beyond the mouse. Disease Models & Mechanisms. 10 (8), 939-942 (2017).
- Cheon, D. J., Orsulic, S. Mouse Models of Cancer. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 6 (1), 95-119 (2011).
- . SEER Cancer Statistics Review, 1975-2016 Available from: https://seer.cancer.gov/csr/1975_2016/ (2018)
- Ribatti, D. Chicken chorioallantoic membrane angiogenesis model. Methods Molecular Biology. 843, 47-57 (2012).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Lokman, N. A., Elder, A. S., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Science. 13 (8), 9959-9970 (2012).
- Xiao, X., et al. Chick Chorioallantoic Membrane Assay: A 3D Animal Model for Study of Human Nasopharyngeal Carcinoma. PLoS ONE. 10 (6), e0130935 (2015).
- Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1119-1130 (2008).
- Shoin, K., et al. Chick Embryo Assay as Chemosensitivity Test for Malignant Glioma. Japanese Journal of Cancer Research. 82 (10), 1165-1170 (1991).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Kavaliauskaitė, D., et al. The Effect of Sodium Valproate on the Glioblastoma U87 Cell Line Tumor Development on the Chicken Embryo Chorioallantoic Membrane and on EZH2 and p53 Expression. BioMed Research International. 2017, 12 (2017).
- Liu, M., et al. The Histone Methyltransferase EZH2 Mediates Tumor Progression on the Chick Chorioallantoic Membrane Assay, a Novel Model of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Translational Oncology. 6 (3), 273-281 (2013).
- Rudy, S. F., et al. In vivo Wnt pathway inhibition of human squamous cell carcinoma growth and metastasis in the chick chorioallantoic model. Journal of Otolaryngology – Head & Neck Surgery. 45 (1), 26 (2016).
- Canale, S., et al. Interleukin-27 inhibits pediatric B-acute lymphoblastic leukemia cell spreading in a preclinical model. Leukemia. 25, 1815 (2011).
- Loos, C., et al. Amino-functionalized nanoparticles as inhibitors of mTOR and inducers of cell cycle arrest in leukemia cells. Biomaterials. 35 (6), 1944-1953 (2014).
- Rovithi, M., et al. Development of bioluminescent chick chorioallantoic membrane (CAM) models for primary pancreatic cancer cells: a platform for drug testing. Scientific Reports. 7, 44686 (2017).
- Majerník, M., et al. Novel Insights into the Effect of Hyperforin and Photodynamic Therapy with Hypericin on Chosen Angiogenic Factors in Colorectal Micro-Tumors Created on Chorioallantoic Membrane. International Journal of Molecular Science. 20 (12), 3004 (2019).
- Swadi, R., et al. Optimising the chick chorioallantoic membrane xenograft model of neuroblastoma for drug delivery. BMC Cancer. 18 (1), 28 (2018).
- Klingenberg, M., Becker, J., Eberth, S., Kube, D., Wilting, J. The chick chorioallantoic membrane as an in vivo xenograft model for Burkitt lymphoma. BMC Cancer. 14 (1), 339 (2014).
- Avram, S., et al. Standardization of A375 human melanoma models on chicken embryo chorioallantoic membrane and Balb/c nude mice. Oncology Reports. 38 (1), 89-99 (2017).
- Zabielska-Koczywas, K., et al. 3D chick embryo chorioallantoic membrane model as an in vivo model to study morphological and histopathological features of feline fibrosarcomas. BMC Veterinary Research. 13 (1), 201 (2017).
- Skowron, M. A., et al. Applying the chicken embryo chorioallantoic membrane assay to study treatment approaches in urothelial carcinoma. Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations. 35 (9), e511-e523 (2017).
- Jefferies, B., et al. Non-invasive imaging of engineered human tumors in the living chicken embryo. Scientific Reports. 7 (1), 4991 (2017).
- Taizi, M., Deutsch, V. R., Leitner, A., Ohana, A., Goldstein, R. S. A novel and rapid in vivo system for testing therapeutics on human leukemias. Experimental Hematology. 34 (12), 1698-1708 (2006).
- Strojnik, T., Kavalar, R., Barone, T. A., Plunkett, R. J. Experimental model and immunohistochemical comparison of U87 human glioblastoma cell xenografts on the chicken chorioallantoic membrane and in rat brains. Anticancer Research. 30 (12), 4851-4860 (2010).
- Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).
- Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).
