Met behulp van de Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model om gynaecologische en urologische kankers studie

Summary

We presenteren het kipchorioallantoïsche membraanmodel als een alternatief, transplanteerbaar, in vivo model voor de engraftment van gynaecologische en urologische kankercellijnen en tumoren die door de patiënt zijn afgeleid.

Abstract

Muismodellen zijn de benchmarktests voor in vivo kankerstudies. Kosten, tijd en ethische overwegingen hebben echter geleid tot oproepen tot alternatieve in vivo kankermodellen. Het kipchorioallantoïsche membraan (CAM) model biedt een goedkoop, snel alternatief dat directe visualisatie van tumorontwikkeling mogelijk maakt en geschikt is voor in vivo beeldvorming. Als zodanig probeerden we een geoptimaliseerd protocol te ontwikkelen voor het enten van gynaecologische en urologische tumoren in dit model, dat we hier presenteren. Ongeveer 7 dagen na bevruchting wordt de luchtcel verplaatst naar de gevasculariseerde kant van het ei, waar een opening in de schaal wordt gecreëerd. Tumoren uit murine en menselijke cellijnen en primaire weefsels kunnen dan worden geënt. Deze zijn meestal gezaaid in een mengsel van extracellulaire matrix en medium om cellulaire verspreiding te voorkomen en bieden voedingsstoffen ondersteuning totdat de cellen werven een vasculaire levering. Tumoren kunnen dan groeien tot een extra 14 dagen voorafgaand aan de eieren uitkomen. Door het implanteren van cellen stabiel getrans-transduced met firefly luciferase, bioluminescentie beeldvorming kan worden gebruikt voor de gevoelige detectie van tumorgroei op het membraan en kankercel verspreid over het embryo. Dit model kan mogelijk worden gebruikt om tumorigeniciteit, invasie, metastase en therapeutische effectiviteit te bestuderen. De kip CAM model vergt aanzienlijk minder tijd en financiële middelen in vergelijking met traditionele murine modellen. Omdat de eieren immuungecompromitteerd en immuuntolerant zijn, kunnen weefsels van elk organisme mogelijk worden geïmplanteerd zonder kostbare transgene dieren (bijvoorbeeld muizen) die nodig zijn voor implantatie van menselijke weefsels. Echter, veel van de voordelen van dit model kan potentieel ook beperkingen, met inbegrip van de korte tumor generatie tijd en immunogecompromitteerde / immuun tolerante status. Bovendien, hoewel alle tumortypes hier engraft in de kip chorioallantoic membraan model, ze doen dit met verschillende mate van tumorgroei.

Introduction

Muizen hebben gediend als het klassieke model organisme voor de studie van menselijke ziekten, met inbegrip van maligniteit. Als zoogdieren, ze delen veel overeenkomsten met de mens. Hun hoge mate van genetische gelijkenis heeft transgene manipulatie van het muizengenoom toegestaan om een enorm inzicht te geven in de genetische bestrijding van menselijke ziekten¹. Uitgebreide ervaring in de behandeling van en experimenteren met muizen heeft geresulteerd in hun zijn het model van keuze voor biomedisch onderzoek. Echter, in aanvulling op de ethische en wetenschappelijke bezorgdheid met betrekking tot murine modellen, kunnen ze ook vrij duur en tijdrovend^2,3. De ontwikkeling van tumoren kan weken of zelfs maanden duren. De huisvesting bij een typische instelling alleen kan draaien in de honderden tot duizenden dollars, terwijl tumoren zich ontwikkelen. Eierstokkanker is een voorbeeld van dit nadeel, omdat de groei van murine modellen kan gemakkelijk maanden duren. Vertragingen in de voortgang van het onderzoek hebben mogelijk gevolgen voor de aanhoudend lage overlevingskans van 5 jaar van 5 jaar van patiënten met eierstokkanker (d.w.z. een toename van de overleving van slechts 10% over 30 jaar)⁴. Op dezelfde manier vormen urologische kankers (nier-, prostaat- en blaaskanker) 19% van alle kankergevallen in de Verenigde Staten en 11% van de sterfgevallen in verband met kanker⁴. Zo kan een nieuwe in vivo benadering van gynaecologische en urologische kankers een laboratorium veel tijd, arbeid en geld besparen, zelfs als dit model alleen wordt toegepast op eerste screeningexperimenten. Bovendien kan de resulterende versnelling van de onderzoeksresultaten aanzienlijke gevolgen hebben voor de 177.000 personen gediagnosticeerd met deze kankers per jaar.

Het kip CAM model biedt vele voordelen die de bovengenoemde problemen aanpakken. Een populair model voor het bestuderen van angiogenese^5,6, tumorcel invasie^7,8, en metastase^7,9, het kuiken embryo CAM model is al gebruikt om vele vormen van kanker te bestuderen, waaronder glioom^10,11,12, hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom^13,14,leukemie^15,16, alvleesklierkanker¹⁷, en colorectale kanker¹⁸. Daarnaast zijn CAM-modellen gegenereerd voor neuroblastoom¹⁹, Burkitt lymfoom²⁰, melanoom²¹, en feline fibrosarcoma²². Eerdere studies hebben ook gepresenteerd engraftment van blaaskanker²³ en prostaatkanker cel lijnen²⁴, maar met beperkte protocol details. Eieren zijn niet alleen veel goedkoper dan muizen, maar produceren ook zeer reproduceerbare resultaten^25,26. Ze tonen een snelle vasculatuur ontwikkeling, en tumor engraftment kan optreden in zo snel als een paar dagen en worden in de lengterichting gevisualiseerd door het open venster. Met het 21 dagen tijdsbestek tussen eibevruchting en uitkomen, kunnen experimenten binnen een paar weken worden voltooid. Bovendien, de lage kosten, beperkte huisvesting behoeften, en kleine omvang gemakkelijk mogelijk grootschalige experimenten die onbetaalbaar zou zijn voor muis studies.

Daarom hebben we geprobeerd om het CAM-model te optimaliseren voor de engraftment van gynaecologische en urologische kankers. Door de immunogecompromitteerde status van het vroege kippenembryo²⁷kunnen zowel muis- als menselijke cellen gemakkelijk worden geïmplanteerd. Als zodanig hebben we met succes geënt eierstokkanker, nier-, prostaat- en blaaskanker. Voor elk van deze tumortypes accepteert de CAM gemakkelijk gevestigde murine- en/of menselijke tumorcellijnen. Belangrijk is dat vers geoogste primaire menselijke tumorweefsels ook kunnen enten van verteerde cellen of stukken vast weefsel met een hoog succespercentage. Elk van deze soorten kanker en celbronnen vereist optimalisatie, die we hier delen.

Protocol

Alle experimenten die hierin werden gepresenteerd werden beoordeeld en goedgekeurd door de juiste ethische commissies aan de Universiteit van Californië, Los Angeles (UCLA). Het gebruik van gedeidentificeerde, primaire menselijke tumoren is goedgekeurd door de UCLA Institutional Review Board (Protocolnummers 17-000037, 17-001169 en 11-001363). Bij UCLA is onderzoek van het Comité voor dieronderzoek niet nodig voor experimenten met kippenembryo’s; protocol goedkeuring is alleen vereist wanneer de eieren zullen worden ui…

Representative Results

Tot nu toe hebben we deze methode van implantatie succesvol gevonden voor eierstokkanker, nier-, prostaat- en blaaskanker. Elk werd geoptimaliseerd om specifieke voorwaarden voor implantatie te identificeren, hoewel er flexibiliteit kan zijn. Van de geteste tumortypes was de groei van eierstokkanker veel minder uitgesproken en meestal niet zichtbaar zonder de hulp van bioluminescentiebeeldvorming(figuur 1). Echter, een versteviging van de CAM kan worden gevoe…

Discussion

Tumorexpansie en -engraftment met behulp van het CAM-model maakt een snellere en direct waarneembare tumorgroei mogelijk dan bestaande in vivo diermodellen. Bovendien zijn de kosten aanzienlijk lager zodra de eerste aankoop van apparatuur is voltooid, vooral in vergelijking met de kosten van immuungecompromitteerde muizen. De eerste, immuungecompromitteerde toestand van kippenembryo’s maakt het gemakkelijk mogelijk engraftment van menselijk en murineweefsel. Zelfs met deze sterke punten heeft het CAM-model beperkingen. D…

Materials

-010 Teflon (PTFE) White 55 Duro Shore D O-Rings	The O-Ring Store	TEF010	Nonstick ring for cell seeding. 1/4"ID X 3/8"OD X 1/16"CS Polytetrafluoroethylene (PTFE).
C4-2	ATCC	CRL-3314	Human prostate cancer cell line.
CWR22Rv1			CWR cells were the kind gift of Dr. David Agus (Keck Medicine of University of Southern California)
Cytokeratin 8/18 Antibody (C-51)	Novus Biologicals	NBP2-44929-0.02mg	Used at a dilution of 1:100 for immunohistochemical analysis of human ovarian CAM tumors.
D-Luciferin Firefly, potassium salt	Goldbio	LUCK-1G
Delicate Operating Scissors; Curved; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4-3/4 in. Overall Length	Roboz Surgical	RS6703	This is provided as an example. Any similar curved scissors would work as well.
Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit	Dremel	8050-N/18	This kit contains all necessary tools.
Fertilized chicken eggs (Rhode Island Red – Brown, Lab Grade)	AA Lab Eggs Inc.	N/A	A local egg supplier would need to be identified, as this supplier only delivers regionally.
HT-1376	ATCC	CRL-1472	Human bladder cancer cell line.
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit	Incubator Warehouse	HB1588D-NONE-1102-1588-1357	Other egg incubators may be used, but their reliability would need to be verified. After implantation, a cell incubator with the CO2 disabled may also be used.
ID8			Not commercially available, please see PMID: 10753190.
Incu-Bright Cool Light Egg Candler	Incubator Warehouse	1102	Other candlers may be used; however, this is preferred among those that we have tested. This candler is included in the aforementioned incubator kit.
Iris Forceps, 10cm, Curved, Serrated, 0.8mm tips	World Precision Instrument	15915	This is provided as an example. Any similar curved forceps would work as well. Multiple brands have been used for this method.
Isoflurane	Clipper Distributing	0010250
IVIS Lumina II In Vivo Imaging System	Perkin Elmer
Matrigel Membrane Matrix HC; LDEV-Free	Corning	354248	Extracellular matrix solution
MyC-CaP	ATCC	CRL-3255	Murine prostate cancer cell line.
Portable Pipet-Aid XP Pipette Controller	Drummond Scientific	4-000-101	Any similar pipet controller would be appropriate.
PrecisionGlide Hypodermic Needles	BD	305196	This is provided as an example. Any 18G needle would work similarly.
RENCA	ATCC	CRL-2947
Semken Forceps	Fine Science Tools	11008-13	This is provided as an example. Any similar forceps or another style that suits researcher preference would be appropriate.
SKOV3	ATCC	HTB-77	Human ovarian cancer cell line.
Specimen forceps	Electron Microscopy Sciences	72914	This is provided as an example. The forceps used for pulling away the shell for bioluminescence imaging are approximately 12.8 cm long with 3 mm-wide tips.
Sterile Cotton Balls	Fisherbrand	22-456-885	This is provided as an example. Any sterile cotton balls would suffice.
Stirring Rods with Rubber Policeman; 5mm diameter, 6 in. length	United Scientific Supplies	GRPL06	This is provided as an example. Any similar glass stir rods would work as well.
T24	ATCC	HTB-4	Human bladder cancer cell line.
Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4"	Moore Medical	21272
Tissue Culture Dishes, 10 cm diameter	Corning	353803	This is provided as an example. Any similar, sterile 10-cm dish may be used. Tissue culture treatment is not necessary.
Tygon Clear Laboratory Tubing – 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet)	Tygon	AACUN017	This is provided as an example. Any similarly sized tubing would work as well.