Verwendung des Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Modells zur Untersuchung gynäkologischer und urologischer Krebsarten

Summary

Wir präsentieren das Hähnchenchorioallanto-Membranmodell als alternatives, transplantierbares In-vivo-Modell zur Transplantation gynäkologischer und urologischer Krebszelllinien und von Patienten abgeleiteter Tumoren.

Abstract

Mausmodelle sind die Benchmark-Tests für In-vivo-Krebsstudien. Kosten, Zeit und ethische Erwägungen haben jedoch zu Forderungen nach alternativen In-vivo-Krebsmodellen geführt. Das Chicken Chorioallantoic Membrane (CAM) Modell bietet eine kostengünstige, schnelle Alternative, die eine direkte Visualisierung der Tumorentwicklung ermöglicht und für die In-vivo-Bildgebung geeignet ist. Als solches haben wir versucht, ein optimiertes Protokoll zur Eindierung gynäkologischer und urologischer Tumoren in dieses Modell zu entwickeln, das wir hier vorstellen. Etwa 7 Tage nach der Befruchtung wird die Luftzelle auf die vaskularisierte Seite des Eis verschoben, wo eine Öffnung in der Schale entsteht. Tumore aus murinen und menschlichen Zelllinien und Primärgeweben können dann transplantiert werden. Diese werden in der Regel in einer Mischung aus extrazellulärer Matrix und Medium gesät, um zelluläre Dispersion zu vermeiden und Nährstoffunterstützung zu bieten, bis die Zellen eine Vaskulärversorgung rekrutieren. Tumore können dann bis zu weiteren 14 Tage vor dem Schlüpfen der Eier wachsen. Durch die Implantation von Zellen, die stabil mit Glühwürmchenluziferase transduziert sind, kann die Biolumineszenz-Bildgebung für den empfindlichen Nachweis des Tumorwachstums auf der Membran und der Krebszelle verwendet werden, die sich im gesamten Embryo ausbreitet. Dieses Modell kann potenziell verwendet werden, um Tumorigenität, Invasion, Metastasierung, und therapeutische Wirksamkeit zu studieren. Das Chicken CAM-Modell benötigt deutlich weniger Zeit und finanzielle Ressourcen im Vergleich zu herkömmlichen murinen Modellen. Da die Eier immungeschwächt und immuntolerant sind, können Gewebe aus jedem Organismus potenziell ohne kostspielige transgene Tiere (z. B. Mäuse) implantiert werden, die für die Implantation von menschlichem Gewebe erforderlich sind. Viele der Vorteile dieses Modells könnten jedoch möglicherweise auch Einschränkungen sein, einschließlich der kurzen Tumorerzeugungszeit und des immungeschwächten/immuntoleranten Status. Darüber hinaus, obwohl alle Tumortypen hier vorgestellt engraft in der Huhn chorioallantoischen Membran-Modell, sie tun dies mit unterschiedlichen Grad des Tumorwachstums.

Introduction

Mäuse haben als klassischer Modellorganismus für die Erforschung menschlicher Krankheiten, einschließlich Malignität, gedient. Als Säugetiere haben sie viele Gemeinsamkeiten mit menschenverachten. Ihr hoher Grad an genetischer Ähnlichkeit hat die transgene Manipulation des Mausgenoms ermöglicht, um einen enormen Einblick in die genetische Kontrolle menschlicher Krankheiten zu geben¹. Umfangreiche Erfahrungen im Umgang mit und Experimentieren mit Mäusen haben dazu geführt, dass sie das Modell der Wahl für die biomedizinische Forschung sind. Jedoch, zusätzlich zu den ethischen und wissenschaftlichen Bedenken in Bezug auf murine Modelle, können sie auch ziemlich teuer und zeitaufwändig^{sein 2,3}. Die Entwicklung von Tumoren kann Wochen oder sogar Monate dauern. Das Gehäuse in einer typischen Institution allein kann in den Hunderten bis Tausenden von Dollar laufen, während Tumore entwickeln. Eierstockkrebs ist ein Beispiel für diesen Nachteil, da sein Wachstum in murinen Modellen leicht Monate dauern kann. Verzögerungen im Forschungsfortschritt wirken sich potenziell auf die anhaltend niedrige 5-Jahres-Überlebensrate von nur 47 % bei Eierstockkrebspatienten aus (d. h. eine Überlebenssteigerung von nur 10 % über 30 Jahre)⁴. In ähnlicher Weise machen urologische Krebserkrankungen (Nieren-, Prostata- und Blasenkrebs) 19 % aller Krebsfälle in den Vereinigten Staaten und 11 % der krebsbedingten Todesfälle^{aus 4}. So könnte ein neuartiger In-vivo-Ansatz zur Untersuchung gynäkologischer und urologischer Krebserkrankungen einem Labor viel Zeit, Arbeit und Geld ersparen, auch wenn dieses Modell nur auf erste Screening-Experimente angewendet wird. Darüber hinaus könnte die daraus resultierende Beschleunigung der Forschungsergebnisse die 177.000 Personen, bei denen diese Krebserkrankungen diagnostiziert werden, signifikant beeinflussen.

Das Huhn CAM-Modell bietet viele Vorteile, die die oben genannten Probleme adressieren. Ein beliebtes Modell zur Untersuchung der Angiogenese^5,6, Tumorzellinvasion^7,8, und Metastasierung^7,9, das Küken Embryo CAM-Modell wurde bereits verwendet, um viele Formen von Krebs zu studieren, einschließlich Gliom^10,11,12, Kopf und Hals Plattenepithelkarzinom^13,14, Leukämie^15,16, Bauchspeicheldrüsenkrebs¹⁷, und Darmkrebs¹⁸. Zusätzlich wurden CAM-Modelle für Neuroblastom¹⁹, Burkitt-Lymphom²⁰, Melanom²¹und Katzenfibrosarkom²²” generiert. Frühere Studien haben auch Die Transplantation von Blasenkrebs²³ und Prostatakrebs-Zelllinien²⁴, aber mit begrenzten Protokolldetails vorgestellt. Eier sind nicht nur viel billiger als Mäuse, sondern produzieren auch hochreproduzierbare Ergebnisse^25,26. Sie zeigen eine schnelle Vaskulaturentwicklung, und Tumorengraftment kann in so schnell wie ein paar Tagen auftreten und längs durch das offene Fenster visualisiert werden. Mit dem 21-Tage-Zeitrahmen zwischen Eibefruchtung und Schlüpfen können Experimente innerhalb weniger Wochen abgeschlossen werden. Darüber hinaus ermöglichen der niedrige Kostenbedarf, der begrenzte Wohnungsbedarf und die geringe Größe problemlos groß angelegte Experimente, die für Mausstudien unerschwinglich wären.

Daher wollten wir das CAM-Modell für die Transplantation gynäkologischer und urologischer Krebserkrankungen optimieren. Aufgrund des immungeschwächten Status des frühen Hühnerembryons²⁷können sowohl Maus- als auch menschliche Zellen problemlos implantiert werden. Als solche haben wir erfolgreich Eierstock-, Nieren-, Prostata- und Blasenkrebs transplantiert. Für jeden dieser Tumortypen akzeptiert das CAM leicht etablierte murine und/oder menschliche Tumorzelllinien. Wichtig ist, dass frisch geerntete primäre menschliche Tumorgewebe auch aus verdauten Zellen oder Stücken festen Gewebes mit hohen Erfolgsraten einwandern können. Jede dieser Krebsarten und Zellquellen erfordert eine Optimierung, die wir hier teilen.

Protocol

Alle hier vorgestellten Experimente wurden von den zuständigen Ethikkommissionen der University of California, Los Angeles (UCLA) überprüft und genehmigt. Die Verwendung von deidentifizierten, primären menschlichen Tumoren wurde vom UCLA Institutional Review Board genehmigt (Protokollnummern 17-000037, 17-001169 und 11-001363). An der UCLA ist für Versuche mit Hühnerembryonen keine Überprüfung durch den Tierforschungsausschuss erforderlich; Eine Protokollgenehmigung ist nur erforderlich, wenn die Eier geschlüpft…

Representative Results

Bisher haben wir festgestellt, dass diese Methode der Implantation bei Eierstock-, Nieren-, Prostata- und Blasenkrebs erfolgreich ist. Jeder wurde optimiert, um spezifische Bedingungen für die Implantation zu identifizieren, obwohl es Flexibilität geben kann. Von den getesteten Tumortypen war das Wachstum von Eierstockkrebs viel weniger ausgeprägt und in der Regel ohne die Hilfe von Biolumineszenz-Bildgebung nicht sichtbar (Abbildung 1). Eine Versteifung d…

Discussion

Die Tumorexpansion und -transplantation mit dem CAM-Modell ermöglicht ein schnelleres und direkt beobachtbares Tumorwachstum als bestehende in vivo-Tiermodelle. Darüber hinaus sind die Kosten nach Abschluss des Erstkaufs der Ausrüstung deutlich niedriger, insbesondere im Vergleich zu den Kosten von immungeschwächten Mäusen. Der anfängliche, immungeschwächte Zustand von Hühnerembryonen ermöglicht leicht die Verpfropfte von menschlichem und murinem Gewebe. Auch mit diesen Stärken hat das CAM-Modell Grenzen. Die k…

Materials

-010 Teflon (PTFE) White 55 Duro Shore D O-Rings	The O-Ring Store	TEF010	Nonstick ring for cell seeding. 1/4"ID X 3/8"OD X 1/16"CS Polytetrafluoroethylene (PTFE).
C4-2	ATCC	CRL-3314	Human prostate cancer cell line.
CWR22Rv1			CWR cells were the kind gift of Dr. David Agus (Keck Medicine of University of Southern California)
Cytokeratin 8/18 Antibody (C-51)	Novus Biologicals	NBP2-44929-0.02mg	Used at a dilution of 1:100 for immunohistochemical analysis of human ovarian CAM tumors.
D-Luciferin Firefly, potassium salt	Goldbio	LUCK-1G
Delicate Operating Scissors; Curved; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4-3/4 in. Overall Length	Roboz Surgical	RS6703	This is provided as an example. Any similar curved scissors would work as well.
Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit	Dremel	8050-N/18	This kit contains all necessary tools.
Fertilized chicken eggs (Rhode Island Red – Brown, Lab Grade)	AA Lab Eggs Inc.	N/A	A local egg supplier would need to be identified, as this supplier only delivers regionally.
HT-1376	ATCC	CRL-1472	Human bladder cancer cell line.
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit	Incubator Warehouse	HB1588D-NONE-1102-1588-1357	Other egg incubators may be used, but their reliability would need to be verified. After implantation, a cell incubator with the CO2 disabled may also be used.
ID8			Not commercially available, please see PMID: 10753190.
Incu-Bright Cool Light Egg Candler	Incubator Warehouse	1102	Other candlers may be used; however, this is preferred among those that we have tested. This candler is included in the aforementioned incubator kit.
Iris Forceps, 10cm, Curved, Serrated, 0.8mm tips	World Precision Instrument	15915	This is provided as an example. Any similar curved forceps would work as well. Multiple brands have been used for this method.
Isoflurane	Clipper Distributing	0010250
IVIS Lumina II In Vivo Imaging System	Perkin Elmer
Matrigel Membrane Matrix HC; LDEV-Free	Corning	354248	Extracellular matrix solution
MyC-CaP	ATCC	CRL-3255	Murine prostate cancer cell line.
Portable Pipet-Aid XP Pipette Controller	Drummond Scientific	4-000-101	Any similar pipet controller would be appropriate.
PrecisionGlide Hypodermic Needles	BD	305196	This is provided as an example. Any 18G needle would work similarly.
RENCA	ATCC	CRL-2947
Semken Forceps	Fine Science Tools	11008-13	This is provided as an example. Any similar forceps or another style that suits researcher preference would be appropriate.
SKOV3	ATCC	HTB-77	Human ovarian cancer cell line.
Specimen forceps	Electron Microscopy Sciences	72914	This is provided as an example. The forceps used for pulling away the shell for bioluminescence imaging are approximately 12.8 cm long with 3 mm-wide tips.
Sterile Cotton Balls	Fisherbrand	22-456-885	This is provided as an example. Any sterile cotton balls would suffice.
Stirring Rods with Rubber Policeman; 5mm diameter, 6 in. length	United Scientific Supplies	GRPL06	This is provided as an example. Any similar glass stir rods would work as well.
T24	ATCC	HTB-4	Human bladder cancer cell line.
Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4"	Moore Medical	21272
Tissue Culture Dishes, 10 cm diameter	Corning	353803	This is provided as an example. Any similar, sterile 10-cm dish may be used. Tissue culture treatment is not necessary.
Tygon Clear Laboratory Tubing – 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet)	Tygon	AACUN017	This is provided as an example. Any similarly sized tubing would work as well.