स्त्री रोग और यूरोलॉजिकल कैंसर का अध्ययन करने के लिए वीवो मॉडल में चिकन कोरिओलांटोइक झिल्ली का उपयोग करना
Summary
हम स्त्री रोग और मूत्र कैंसर कोशिका लाइनों और रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर के एनग्राफमेंट के लिए वीवो मॉडल में चिकन कोरिओलैंटोइक झिल्ली मॉडल को एक विकल्प, प्रत्यारोपण योग्य के रूप में प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
माउस मॉडल वीवो कैंसर अध्ययन में बेंचमार्क परीक्षण हैं। हालांकि, लागत, समय, और नैतिक विचार ों के कारण वीवो कैंसर मॉडल में वैकल्पिक के लिए कॉल किया गया है। चिकन कोरियोएलन्टोइक झिल्ली (सीएएम) मॉडल एक सस्ता, तेजी से विकल्प प्रदान करता है जो ट्यूमर विकास के प्रत्यक्ष दृश्य की अनुमति देता है और वीवो इमेजिंग में उपयुक्त है। जैसे, हमने इस मॉडल में स्त्री रोग और मूत्र संबंधी ट्यूमर को एनग्राफ्टिंग करने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल विकसित करने की मांग की, जिसे हम यहां प्रस्तुत करते हैं। लगभग 7 दिन पोस्टफर्टिलाइजेशन, एयर सेल को अंडे के संवहनी पक्ष में ले जाया जाता है, जहां खोल में एक उद्घाटन बनाया जाता है। murine और मानव कोशिका लाइनों और प्राथमिक ऊतकों से ट्यूमर तो engrafted किया जा सकता है । ये आम तौर पर सेलुलर फैलाव से बचने के लिए बाह्य मैट्रिक्स और मध्यम के मिश्रण में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं और पोषक तत्वों का समर्थन प्रदान करते हैं जब तक कि कोशिकाएं संवहनी आपूर्ति की भर्ती नहीं करतीहैं। ट्यूमर तो अंडे हैचिंग से पहले एक अतिरिक्त 14 दिनों के लिए विकसित हो सकता है । जुगनू लूसिफ़ेरेज़ के साथ कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करके, पूरे भ्रूण में फैले झिल्ली और कैंसर कोशिका पर ट्यूमर के विकास के संवेदनशील पता लगाने के लिए बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग का उपयोग किया जा सकता है। इस मॉडल का उपयोग संभावित रूप से ट्यूमर, आक्रमण, मेटाटैसिस और चिकित्सीय प्रभावशीलता का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। चिकन कैम मॉडल पारंपरिक मूत्र मॉडल की तुलना में काफी कम समय और वित्तीय संसाधनों की आवश्यकता है। क्योंकि अंडे इम्यूनोसमझौता और प्रतिरक्षा सहिष्णु हैं, किसी भी जीव से ऊतकों को संभावित रूप से मानव ऊतकों के प्रत्यारोपण के लिए आवश्यक महंगे ट्रांसजेनिक जानवरों (जैसे, चूहों) के बिना प्रत्यारोपित किया जा सकता है। हालांकि, इस मॉडल के लाभों के कई संभवतः भी सीमाएं हो सकती है, कम ट्यूमर पीढ़ी के समय और इम्यूनोसमझौता/ इसके अतिरिक्त, हालांकि सभी ट्यूमर प्रकार चिकन chorioallantoic झिल्ली मॉडल में यहां प्रस्तुत किया, वे ट्यूमर के विकास की डिग्री बदलती के साथ ऐसा करते हैं ।
Introduction
चूहों ने मानव रोगों के अध्ययन के लिए क्लासिक मॉडल जीव के रूप में कार्य किया है, जिसमें द्रोह भी शामिल है । स्तनधारियों के रूप में, वे मनुष्यों के साथ कई समानताएं साझा करते हैं। उनकी उच्च स्तर की आनुवंशिक समानता ने माउस जीनोम के ट्रांसजेनिक हेरफेर की अनुमति दी है ताकि मानव रोगों के आनुवंशिक नियंत्रण के बारे में अत्यधिक जानकारी प्रदान की जा सके। चूहों के साथ हैंडलिंग और प्रयोग में व्यापक अनुभव के परिणामस्वरूप उनके जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए पसंद का मॉडल है। हालांकि, मूत्र मॉडल के बारे में नैतिक और वैज्ञानिक चिंताओं के अलावा, वे काफी महंगे और समय लेने वाले2,3 भी हो सकतेहैं। ट्यूमर के विकास में सप्ताह या महीनों भी लग सकते हैं। अकेले एक ठेठ संस्था में आवास डॉलर के हजारों के लिए सैकड़ों में चला सकते हैं, जबकि ट्यूमर विकसित कर रहे हैं । ओवेरियन कैंसर इस खामी का एक उदाहरण है क्योंकि मूत्र मॉडल में इसकी वृद्धि में आसानी से महीनों लग सकते हैं। अनुसंधान प्रगति में देरी संभावित प्रभाव अंडाशय कैंसर रोगियों ‘ लगातार कम 5 साल के जीवित रहने की दर केवल ४७% (यानी, 30 साल से अधिक केवल 10% के अस्तित्व में वृद्धि)4। इसी तरह, यूरोलॉजिकल कैंसर (गुर्दे, प्रोस्टेट, और मूत्राशय के कैंसर) संयुक्त राज्य अमेरिका में सभी कैंसर के मामलों का 19% और कैंसर से संबंधित मौतों का 11% का गठन4। इस प्रकार, स्त्री रोग और मूत्र संबंधी कैंसर का अध्ययन करने के लिए वीवो दृष्टिकोण में एक उपन्यास एक प्रयोगशाला काफी समय, श्रम और धन को बचा सकता है, भले ही यह मॉडल केवल प्रारंभिक स्क्रीनिंग प्रयोगों पर लागू हो। इसके अतिरिक्त, अनुसंधान निष्कर्षों के परिणामस्वरूप त्वरण काफी १७७,००० इन कैंसर के साथ सालाना का निदान व्यक्तियों को प्रभावित कर सकता है ।
चिकन कैम मॉडल कई फायदे प्रदान करता है जो उपरोक्त मुद्दों को संबोधित करते हैं। एंजियोजेनेसिस5,6,ट्यूमर सेल आक्रमण7,8,और मेटास्तासिस7,9का अध्ययन करने के लिए एक लोकप्रिय मॉडल, चिक भ्रूण कैम मॉडल का उपयोग पहले से ही कैंसर के कई रूपों का अध्ययन करने के लिए किया जा चुका है, जिसमें ग्लियोमा10,11,12,सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा13,14,ल्यूकीमिया15,16,अग्नाशय का कैंसर17,और कोलोरेक्टल कैंसर18. इसके अतिरिक्त, न्यूरोब्लास्टोमा19,बर्किट लिंफोमा20,मेलानोमा21और फेलिन फाइब्रोसारकोमा22के लिए कैम मॉडल उत्पन्न किए गए हैं। पूर्व अध्ययनों में मूत्राशय के कैंसर23 और प्रोस्टेट कैंसर सेल लाइनों24का एनग्राफमेंट भी प्रस्तुत किया गया है, लेकिन सीमित प्रोटोकॉल विवरण के साथ। न केवल चूहों की तुलना में अंडे बहुत सस्ते होते हैं, बल्कि वे25,26के अत्यधिक प्रजनन योग्य परिणाम भी पैदा करते हैं। वे तेजी से वास्कुलचर विकास दिखाते हैं, और ट्यूमर एनग्राफमेंट कुछ दिनों के रूप में जल्दी हो सकता है और खुली खिड़की के माध्यम से देशवासी कल्पना की जा सकती है। अंडे निषेचन और हैचिंग के बीच 21 दिन की समय सीमा के साथ, प्रयोगों को कुछ हफ्तों के भीतर पूरा किया जा सकता है। इसके अलावा, कम लागत, सीमित आवास की जरूरत है, और छोटे आकार आसानी से बड़े पैमाने पर प्रयोगों की अनुमति है कि माउस अध्ययन के लिए निषेधात्मक होगा ।
इसलिए, हमने स्त्री रोग और मूत्र कैंसर के एनग्राफमेंट के लिए कैम मॉडल को अनुकूलित करने की मांग की। जल्दी चिकन भ्रूण27की इम्यूनोसमझौता स्थिति के कारण, माउस और मानव कोशिकाओं दोनों को आसानी से प्रत्यारोपित किया जा सकता है। जैसे, हमने ओवेरियन, किडनी, प्रोस्टेट और मूत्राशय के कैंसर को सफलतापूर्वक एनग्राफेड किया है। इन ट्यूमर प्रकार ों में से प्रत्येक के लिए, कैम आसानी से स्थापित मूत्र और/या मानव ट्यूमर सेल लाइनों को स्वीकार करता है । महत्वपूर्ण बात, हौसले से काटा प्राथमिक मानव ट्यूमर ऊतकों भी या तो पचा कोशिकाओं या सफलता की उच्च दरों के साथ ठोस ऊतक के टुकड़े से engraft कर सकते हैं । इन कैंसर प्रकारों और कोशिका स्रोतों में से प्रत्येक अनुकूलन की आवश्यकता है, जो हम यहां साझा करते हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
कैम मॉडल का उपयोग करके ट्यूमर विस्तार और engraftment वीवो पशु मॉडल में मौजूदा की तुलना में अधिक तेजी से और सीधे नमूदार ट्यूमर विकास की अनुमति देता है। इसके अलावा, उपकरणों की प्रारंभिक खरीद पूरी होने के बाद लाग?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक इस विधि पर प्रारंभिक प्रशिक्षण के लिए डॉ फुयुहिको तमनोई और बिन्ह वु का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । डॉ ईवा कोजिओलेक के साथ विचार-विमर्श इस दृष्टिकोण को अनुकूलित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है और इसकी बहुत सराहना की गई है । यह काम निम्नलिखित स्रोतों से धन के बिना संभव नहीं होता: तंबाकू से संबंधित रोग अनुसंधान कार्यक्रम पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप (27FT-0023, एसीएस के लिए), रक्षा विभाग (DoD) अंडाशय कैंसर अनुसंधान कार्यक्रम (W81XWH-17-1-0160), NCI/NIH (1R21CA216770), तंबाकू से संबंधित रोग अनुसंधान कार्यक्रम उच्च प्रभाव पायलट पुरस्कार (27IR-0016), और UCLA संस्थागत समर्थन, जिसमें जेसीसीसी बीज अनुदान (एनसीआई/एनआईएच पी30सीए016042) और अनुसंधान के लिए कुलपति के कार्यालय से एलडब्ल्यू को 3आर अनुदान शामिल है ।
Materials
| -010 Teflon (PTFE) White 55 Duro Shore D O-Rings | The O-Ring Store | TEF010 | Nonstick ring for cell seeding. 1/4"ID X 3/8"OD X 1/16"CS Polytetrafluoroethylene (PTFE). |
| C4-2 | ATCC | CRL-3314 | Human prostate cancer cell line. |
| CWR22Rv1 | CWR cells were the kind gift of Dr. David Agus (Keck Medicine of University of Southern California) | ||
| Cytokeratin 8/18 Antibody (C-51) | Novus Biologicals | NBP2-44929-0.02mg | Used at a dilution of 1:100 for immunohistochemical analysis of human ovarian CAM tumors. |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| Delicate Operating Scissors; Curved; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4-3/4 in. Overall Length | Roboz Surgical | RS6703 | This is provided as an example. Any similar curved scissors would work as well. |
| Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | This kit contains all necessary tools. |
| Fertilized chicken eggs (Rhode Island Red – Brown, Lab Grade) | AA Lab Eggs Inc. | N/A | A local egg supplier would need to be identified, as this supplier only delivers regionally. |
| HT-1376 | ATCC | CRL-1472 | Human bladder cancer cell line. |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D-NONE-1102-1588-1357 | Other egg incubators may be used, but their reliability would need to be verified. After implantation, a cell incubator with the CO2 disabled may also be used. |
| ID8 | Not commercially available, please see PMID: 10753190. | ||
| Incu-Bright Cool Light Egg Candler | Incubator Warehouse | 1102 | Other candlers may be used; however, this is preferred among those that we have tested. This candler is included in the aforementioned incubator kit. |
| Iris Forceps, 10cm, Curved, Serrated, 0.8mm tips | World Precision Instrument | 15915 | This is provided as an example. Any similar curved forceps would work as well. Multiple brands have been used for this method. |
| Isoflurane | Clipper Distributing | 0010250 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel Membrane Matrix HC; LDEV-Free | Corning | 354248 | Extracellular matrix solution |
| MyC-CaP | ATCC | CRL-3255 | Murine prostate cancer cell line. |
| Portable Pipet-Aid XP Pipette Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | Any similar pipet controller would be appropriate. |
| PrecisionGlide Hypodermic Needles | BD | 305196 | This is provided as an example. Any 18G needle would work similarly. |
| RENCA | ATCC | CRL-2947 | |
| Semken Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | This is provided as an example. Any similar forceps or another style that suits researcher preference would be appropriate. |
| SKOV3 | ATCC | HTB-77 | Human ovarian cancer cell line. |
| Specimen forceps | Electron Microscopy Sciences | 72914 | This is provided as an example. The forceps used for pulling away the shell for bioluminescence imaging are approximately 12.8 cm long with 3 mm-wide tips. |
| Sterile Cotton Balls | Fisherbrand | 22-456-885 | This is provided as an example. Any sterile cotton balls would suffice. |
| Stirring Rods with Rubber Policeman; 5mm diameter, 6 in. length | United Scientific Supplies | GRPL06 | This is provided as an example. Any similar glass stir rods would work as well. |
| T24 | ATCC | HTB-4 | Human bladder cancer cell line. |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 21272 | |
| Tissue Culture Dishes, 10 cm diameter | Corning | 353803 | This is provided as an example. Any similar, sterile 10-cm dish may be used. Tissue culture treatment is not necessary. |
| Tygon Clear Laboratory Tubing – 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | This is provided as an example. Any similarly sized tubing would work as well. |
Referências
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