Utilizzo del modello di membrana coroallantoica di pollo in vivo per studiare i tumori ginecologici e urologici

Summary

Vi presentiamo il modello di membrana corioallantoica del pollo come modello alternativo, trapiantabile, in vivo per l’innesto di linee cellulari del cancro ginecologico e urologico e tumori derivati dal paziente.

Abstract

I modelli murini sono i test di riferimento per gli studi sul cancro in vivo. Tuttavia, i costi, i tempi e le considerazioni etiche hanno portato a richieste di modelli alternativi di cancro in vivo. Il modello di membrana corioalltoica di pollo (CAM) fornisce un’alternativa rapida e economica che consente la visualizzazione diretta dello sviluppo del tumore ed è adatta per l’imaging in vivo. Come tale, abbiamo cercato di sviluppare un protocollo ottimizzato per l’ingoiare i tumori ginecologici e urologici in questo modello, che presentiamo qui. Circa 7 giorni dopo la fecondazione, la cella d’aria viene spostata sul lato vascolarizzato dell’uovo, dove viene creata un’apertura nel guscio. I tumori da linee cellulari murine e umane e tessuti primari possono quindi essere innestati. Questi sono tipicamente semi in una miscela di matrice extracellulare e mezzo per evitare la dispersione cellulare e fornire supporto nutritivo fino a quando le cellule reclutano una fornitura vascolare. I tumori possono quindi crescere fino a 14 giorni aggiuntivi prima della schiusa delle uova. Impiantando cellule correttamente trasdotte con luciferasi della lucciola, l’imaging della bioluminescenza può essere utilizzato per il rilevamento sensibile della crescita tumorale sulla membrana e le cellule tumorali si diffondono in tutto l’embrione. Questo modello può essere potenzialmente utilizzato per studiare la tumorigenicità, l’invasione, la metastasi e l’efficacia terapeutica. Il modello di pollo CAM richiede molto meno tempo e risorse finanziarie rispetto ai modelli murini tradizionali. Poiché le uova sono immunocompromesse e tolleranti immunitarie, i tessuti di qualsiasi organismo possono essere potenzialmente impiantati senza costosi animali transgenici (ad esempio, topi) necessari per l’impianto dei tessuti umani. Tuttavia, molti dei vantaggi di questo modello potrebbero potenzialmente essere anche limitazioni, tra cui il breve tempo di generazione del tumore e lo stato di tolleranza immunocompromessa/immune. Inoltre, anche se tutti i tipi di tumore presentati qui innesto nel modello di membrana corioallantoica di pollo, lo fanno con vari gradi di crescita del tumore.

Introduction

I topi sono serviti come il classico organismo modello per lo studio delle malattie umane, compresa la malignità. Come mammiferi, condividono molte somiglianze con gli esseri umani. Il loro alto grado di somiglianza genetica ha permesso la manipolazione transgenica del genoma del topo per fornire enormi informazioni sul controllo genetico delle malattie umane¹. Un’ampia esperienza nella gestione e sperimentazione dei topi ha portato al loro essere il modello di scelta per la ricerca biomedica. Tuttavia, oltre alle preoccupazioni etiche e scientifiche riguardanti i modelli murini, possono anche essere piuttosto costose e dispendiose in termini di tempo^2,3. Lo sviluppo dei tumori può richiedere settimane o addirittura mesi. L’alloggiamento in un’istituzione tipica da solo può funzionare in centinaia a migliaia di dollari mentre i tumori si stanno sviluppando. Il cancro ovarico è un esempio di questo inconveniente perché la sua crescita nei modelli murini può facilmente richiedere mesi. I ritardi nei progressi della ricerca hanno un potenziale impatto sul tasso di sopravvivenza a 5 anni dei pazienti affetti da cancro ovarico, pari solo al 47% (ossia un aumento della sopravvivenza di appena il 10% in 30 anni)⁴. Allo stesso modo, i tumori urologici (cancro del rene, della prostata e della vescica) costituiscono il 19% di tutti i casi di cancro negli Stati Uniti e l’11% dei decessi correlati al cancro⁴. Così, un nuovo approccio in vivo per studiare i tumori ginecologici e urologici potrebbe far risparmiare a un laboratorio molto tempo, lavoro e denaro, anche se questo modello viene applicato solo agli esperimenti di screening iniziali. Inoltre, la conseguente accelerazione dei risultati della ricerca potrebbe avere un impatto significativo i 177.000 individui diagnosticati con questi cancri ogni anno.

Il modello CAM di pollo offre molti vantaggi che affrontano i problemi di cui sopra. Un modello popolare per studiare l’angiogenesi^5,6, invasione delle cellule tumorali^7,8, e metastasi^7,9, il modello CAM embrione pulcino è già stato utilizzato per studiare molte forme di cancro, tra cui glioma^10,11,12, testa e collo carcinoma a cellule squamose^13,14, leucemia^15,16, cancro al pancreas¹⁷, cancro colorettale¹⁸. Inoltre, sono stati generati modelli CAM per neuroblastoma¹⁹, linfoma Burkitt²⁰, melanoma²¹e fibrosarcoma felino²². Studi precedenti hanno anche presentato l’innesto di cancro della vescica²³ e linee cellulari del cancro alla prostata²⁴, ma con dettagli di protocollo limitati. Non solo le uova sono molto più economiche dei topi, ma producono anche risultati altamente riproducibili^25,26. Essi mostrano lo sviluppo di vascolatura veloce, e l’afflusso di tumore può verificarsi in più rapidamente come pochi giorni ed essere visualizzato longitudinalmente attraverso la finestra aperta. Con il periodo di tempo di 21 giorni tra la fecondazione ovula e la schiusa, gli esperimenti possono essere completati in poche settimane. Inoltre, il basso costo, le limitate esigenze abitative e le piccole dimensioni consentono facilmente esperimenti su larga scala che sarebbero proibitivi per gli studi sui topi.

Pertanto, abbiamo cercato di ottimizzare il modello CAM per l’innesto di tumori ginecologici e urologici. A causa dello stato immunocompromesso del primo embrione di pollo²⁷, sia le cellule del topo che quella umana possono essere facilmente impiantate. Come tale, abbiamo innestato con successo tumori ovarici, renali, prostatici e della vescica. Per ciascuno di questi tipi di tumore, la CAM accetta prontamente le linee cellulari del topo e/o del tumore umano. È importante sottolineare che i tessuti tumorali primari appena raccolti possono anche innestare cellule digerite o pezzi di tessuto solido con alti tassi di successo. Ognuno di questi tipi di cancro e fonti cellulari richiede ottimizzazione, che condividiamo qui.

Protocol

Tutti gli esperimenti qui presentati sono stati esaminati e approvati dai comitati etici competenti dell’Università della California, Los Angeles (UCLA). L’uso di tumori umani primari e identificati è stato approvato dall’UCLA Institutional Review Board (numeri di protocollo 17-000037, 17-001169 e 11-001363). All’UCLA, la revisione del Comitato per la ricerca sugli animali non è necessaria per gli esperimenti che utilizzano embrioni di pollo; l’approvazione del protocollo è necessaria solo quando le uova saranno cova…

Representative Results

Finora, abbiamo trovato questo metodo di impianto per avere successo per i tumori ovarici, renali, prostatici e della vescica. Ognuna è stata ottimizzata per identificare condizioni specifiche per l’impianto, anche se ci può essere flessibilità. Tra i tipi di tumore testati, la crescita del cancro ovarico era molto meno pronunciata e in genere non visibile senza l’assistenza dell’imaging a bioluminescenza (Figura 1). Tuttavia, un irrigidimento della CAM po…

Discussion

L’espansione e l’innesto del tumore con il modello CAM consentono una crescita tumorale più rapida e direttamente osservabile rispetto ai modelli animali in vivo esistenti. Inoltre, i costi sono significativamente più bassi una volta completato l’acquisto iniziale di attrezzature, soprattutto se confrontato con il costo dei topi immunocompromessi. Lo stato iniziale, immunocompromesso degli embrioni di pollo, consente facilmente l’innesto di tessuto umano e murino. Anche con questi punti di forza, il modello CAM ha dell…

Materials

-010 Teflon (PTFE) White 55 Duro Shore D O-Rings	The O-Ring Store	TEF010	Nonstick ring for cell seeding. 1/4"ID X 3/8"OD X 1/16"CS Polytetrafluoroethylene (PTFE).
C4-2	ATCC	CRL-3314	Human prostate cancer cell line.
CWR22Rv1			CWR cells were the kind gift of Dr. David Agus (Keck Medicine of University of Southern California)
Cytokeratin 8/18 Antibody (C-51)	Novus Biologicals	NBP2-44929-0.02mg	Used at a dilution of 1:100 for immunohistochemical analysis of human ovarian CAM tumors.
D-Luciferin Firefly, potassium salt	Goldbio	LUCK-1G
Delicate Operating Scissors; Curved; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4-3/4 in. Overall Length	Roboz Surgical	RS6703	This is provided as an example. Any similar curved scissors would work as well.
Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit	Dremel	8050-N/18	This kit contains all necessary tools.
Fertilized chicken eggs (Rhode Island Red – Brown, Lab Grade)	AA Lab Eggs Inc.	N/A	A local egg supplier would need to be identified, as this supplier only delivers regionally.
HT-1376	ATCC	CRL-1472	Human bladder cancer cell line.
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit	Incubator Warehouse	HB1588D-NONE-1102-1588-1357	Other egg incubators may be used, but their reliability would need to be verified. After implantation, a cell incubator with the CO2 disabled may also be used.
ID8			Not commercially available, please see PMID: 10753190.
Incu-Bright Cool Light Egg Candler	Incubator Warehouse	1102	Other candlers may be used; however, this is preferred among those that we have tested. This candler is included in the aforementioned incubator kit.
Iris Forceps, 10cm, Curved, Serrated, 0.8mm tips	World Precision Instrument	15915	This is provided as an example. Any similar curved forceps would work as well. Multiple brands have been used for this method.
Isoflurane	Clipper Distributing	0010250
IVIS Lumina II In Vivo Imaging System	Perkin Elmer
Matrigel Membrane Matrix HC; LDEV-Free	Corning	354248	Extracellular matrix solution
MyC-CaP	ATCC	CRL-3255	Murine prostate cancer cell line.
Portable Pipet-Aid XP Pipette Controller	Drummond Scientific	4-000-101	Any similar pipet controller would be appropriate.
PrecisionGlide Hypodermic Needles	BD	305196	This is provided as an example. Any 18G needle would work similarly.
RENCA	ATCC	CRL-2947
Semken Forceps	Fine Science Tools	11008-13	This is provided as an example. Any similar forceps or another style that suits researcher preference would be appropriate.
SKOV3	ATCC	HTB-77	Human ovarian cancer cell line.
Specimen forceps	Electron Microscopy Sciences	72914	This is provided as an example. The forceps used for pulling away the shell for bioluminescence imaging are approximately 12.8 cm long with 3 mm-wide tips.
Sterile Cotton Balls	Fisherbrand	22-456-885	This is provided as an example. Any sterile cotton balls would suffice.
Stirring Rods with Rubber Policeman; 5mm diameter, 6 in. length	United Scientific Supplies	GRPL06	This is provided as an example. Any similar glass stir rods would work as well.
T24	ATCC	HTB-4	Human bladder cancer cell line.
Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4"	Moore Medical	21272
Tissue Culture Dishes, 10 cm diameter	Corning	353803	This is provided as an example. Any similar, sterile 10-cm dish may be used. Tissue culture treatment is not necessary.
Tygon Clear Laboratory Tubing – 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet)	Tygon	AACUN017	This is provided as an example. Any similarly sized tubing would work as well.